Исследование активности рекомбинантного белка LIF про- и эукариотического происхождения на культуре эмбриональных стволовых клеток мыши

• Автор: Петрова, Раушания Рашитовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 135 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ЦИТОКИНЫ СЕМЕЙСТВА I.

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1.3. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА

1.4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА I.

1.5. ЗНАЧЕНИЕ ИЗОФОРМ ЦИТОКИНА I

1.6. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ I НА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

1.7. ПУТИ IСИГНАЛИЗАЦИИ В ЭСК

1.8. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ i vi

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ.
2.2. КЛОНИРОВАНИЕ КДНК ГЕНА .
2.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА i
2.5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКОГО БЕЛКА I
2.6. БЕЛКОВЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ.
2.7. ДИАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА I.
2.8. БЛОТ АНАЛИЗ ИММУНОБЛОТТИНГ.
2.9. ПОЛУЧЕНИЕ I В КЛЕТКАХ ЛИНИИ
2 ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА I.
. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ИФА.
. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I.
2 ТЕСТИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ I НА ЭСК МЫШИ.
2 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭСК i vi
. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ ЭСК
. ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ВРЕМЯ УДВОЕНИЯ.
. ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ НА ВЫЯВЛЕНИЕ ЭЩФ
2 ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭСК МЫШИ ЛИНИИ 1 i vi
2 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА В РАЗНЫХ ТИПАХ КЛЕТОК.
3.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ 1
3.3. ИНДУКЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭСК МЫШИ В УСЛОВИЯХ ПРОЛОНГИРОВАННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С I.
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Широкий спектр действия I на ЭСК связан с тем, что этот регуляторный белок способен активировать разные каскады цитоплазматических реакций и, соответственно, разные генымишени, ответственные за плюрипотентность, пролиферативную активность и дифференцировку. Аналогичная картина выявляется при действии на ЭСК рекомбинантных цитокинов I, полученных на основе микроорганизмов или же клеток млекопитающих i . Несмотря на огромный фактический материал, в вопросах I регуляции ЭСК млекопитающих остается много неизвестного. Этот цитокин необходим разным видам для поддержания i vi генетически стабильных линий плюрипотентных клеток из ранних зародышей на стадии бластоцисты . Vii, , iiii, . Связано ли это с видовыми особенностями ЭСК или же с различиями в свойствах рекомбинантного I, остается не ясным. Для ответа на эти вопросы необходимы сравнительные исследования. Данные литературы, полученные на разных линиях ЭСК, в разных системах культивирования с коммерческими препаратами рекомбинантного I, полученными разными способами, сравнивать трудно. Они обнаруживают биохимическую и видовую гетерогенность i . Возможно, что на биологическую активность рекомбинантного I влияет не только первичная структура этого белка, но и его постгрансляционные модификации, что весьма вероятно при использовании разных систем экспрессии. Для получения ответов на эти вопросы необходимы сравнительные исследования функциональной активности продуктов экспрессии одного гена i при действии на стабильную Iзависимую культуру клеток. В связи с этим целью наших исследований было определение активности рекомбинантного белка I мыши, полученного в результате экспрессии одного гена i в про и эукариотических клеткахпродуцентах, и исследование характера действия на гшорипотентность и дифференцировку Iзависимой линии ЭСК мыши для того, чтобы проверить, влияет ли система экспрессии на функциональные свойства рекомбинантного белка I. Конструирование экспрессионных векторных систем со встроенным геном i мыши для про и эукариотических клетокпродуцентов, выделение и хроматографическая очистка рекомбинантных белков I. Оптимизация условий для введения плазмидных конструкций и отбор клетокпродуцентов со стабильной экспрессией гена i мыши. Сравнение биологической активности рекомбинантного белка I про и эукариотического происхождения при действии на плюрипотентные ЭСК мыши в культуре i vi. Оценка скорости и характера роста, а также способности рекомбинантного I поддерживать ЭСК мыши в плюрипотентном состоянии в зависимости от способов очистки, концентрации I в среде и длительности культивирования. Анализ способности рекомбинантного белка I мыши влиять на процессы цитодифференцировки ЭСК в условиях пролонгированного культивирования. ЦИТОКИНЫ СЕМЕЙСТВА 1. Цитокин принадлежит к семейству интерлейкина6 I6, куда входят также I6, I, кардиотропин1 СТ1, онкостатин М , целюлярный нейрональный трофический фактор и недавно открытый кардиотропин подобный цитокинцитокинподобный фактор iii iii 1, i, . Некоторые из перечисленных цитокинов I, , СТ1 и связываются с ацепью Iрецептора. Связывание каждого цитокина с его рецептором приводит к димеризации с трансмембранным гликопротеином и, в результате, образованию высокоаффинного рецептора с последующей активацией сигнального трансдуктора i, пути передачи сигнала и фактора транскрипции i, . ЭСК i, ii . I6, I1 и . I4,1 . Показано, что продукция I взаимосвязана с процессами инфекции и воспаления i . При исследовании сывороток здоровых и больных пациентов была найдена корреляция между количеством циркулирующего в крови I и степенью воспаления. В сыворотке здоровых людей цитокин I в основном не диагностируется. Сыворотка пациентов с мягкой инфекцией или воспалением содержит низкий уровень I, в то время как пациенты с септическим шоком обнаруживают достаточно высокий уровень I в крови i . Физиологически наиболее важное и интересное место продукции I это эндометрий . Максимального значения концентрация I в эндометрии достигает в период имплантации бластоцисты в матку . Это показано не только на мышах, но и на других млекопитающих i . Цитокин I сильный иммунноэндокринный модулятор, играющий ключевую роль в процессах подержания беременности у животных и человека i , Vii, .