Деградация гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами

• Автор: Горбатова, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура триазиновых пестицидов

1.2. Циркуляция триазиновых пестицидов в экосистемах

1.3. Общие принципы действия атразина на живые организмы и его метаболизм

1.4. Действие триазиновых пестицидов на живые организмы.

1.4.1. Высшие растения и водоросли

1.4.2. Беспозвоночные.

1.4.3. Позвоночные

1.4.4. Бактерии и грибы.

1.5. Биодеградация триазиновых соединений.

1.5.1. Высшие растения и водоросли.
1.5.2. Млекопитающие.
1.5.3. Бактерии
1.5.4. Грибы.
1.5.4.1 Лигнинпероксидазы
1.5.4.2 Марганецпероксидазы
1.5.4.3 Лакказы
1.6. Неферментативная деструкция триазиновых соединений.
1.7. Заключение.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы, используемые в работе.
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Комплексы рутения.
2.1.3. Штаммы
2.2. Поверхностное культивирование
2.3. Глубинное культивирование
2.4. Индукция биосинтеза лакказы при глубинном культивировании
2.4.1. Индукция биосинтеза лакказы базидиомицета СогШия ЫпШш при получении индуцибельных форм фермента.
2.4.2. Индукция биосинтеза лакказы при деструкции атразина
2.5. Выделение и очистка конститутивных и индуцибельных форм лакказы.
2.6. Определение молекулярных масс ферментов.
2.7. Определение активности оксидоредуктаз.
2.7.1. Активность лакказы.
2.7.2. Активность Мппероксидазы
2.8. Спектральные измерения.
2.9. Определение количества ионов меди.
2 Определение оптимумов каталитической активности лакказы.
2 Определение термостабильности или термической инактивации лакказы
2 Определение оптимумов температуры каталитической активности лакказы
2 Определение кинелических параметров субстратов лакказы.
2 Анализ углеводной части лакказы
2 Анализ аминокислотного состава лакказы.
2 Определение концентрации белка.
2 Определение концентрации атразина методом иммуноферментного анализа
2 Определение сорбции атразина на мицелии базидиальных грибов
2 Методы анализа систем медиаторлакказа Согю1ор5 иЫос тегеа .
. Электрохимическая характеристика медиаторов.
. Спектрофотометрия медиаторов, систем атразинмедиатор и атразинмедиаторлакказа
2 Модельные системы атразинмедиаторлакказа Сопо1ор.шиЬостегеа и анализ образующихся продуктов трансформации
. Состав модельных систем.
. Анализ модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
. Анализ методом протонного ядерного магнитного резонанса.
. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
тандемной массспектрометрии
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм лакказы Согоиз Ыпшш
3.1.1. Глубинное культивирование Согош ИгзШиз, выделение и очистка форм фермента
3.1.2. Биохимические свойства форм лакказы Согоиз Ьпшш.
3.1.3. Физикохимические свойства форм лакказы Согош ИгбШш.
3.1.4. Субстратная специфичность лакказ.
3.2. Влияние индукторов на деградацию атразина и биосинтез оксидоредуктаз при глубинном культивировании базидиомицетов.
3.2.1. Изменение Мпиероксидазной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина
3.2.2. Динамика лакказной активности в глубинной культуре в отсутствие и в присутствии атразина
3.2.3. Выбор индуктора и времени его внесения.
3.2.4. Изучение сорбции атразина на мицелии.
3.3. Характеристика внеклеточной лакказы базидиомицета СогоорьзиЫостегеа
3.4. Сравнительная характеристика субстратов, используемых в качестве медиаторов в реакции с лакказой базидиомицета Согоор5ихоспегеа.
3.4.1. Электрохимическая характеристика медиаторов
3.4.2. Изучение кинетических параметров исследуемых субстратов.
3.5. Исследование трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу Согоорзяихоспегеа и редоксмедиатор.
3.5.1. Характеристика модельных систем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3.5.2. Характеристика продуктов трансформации атразина в модельных системах методом протонного ядерного магнитного резонанса
3.5.3. Исследование продуктов трансформации атразина в модельных системах методом высокоэффективной жидкостной хроматографиитандем ной масс
спектрометрии.
3.6. Механизм окисления атразина лакказой в присутствии редоксмедиатора ГБТ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Представленный выше анализ ситуации свидетельствует об актуальности создания новых биотехнологических методов деструкции пестицидов, в том числе атразина. Лакказа является перспективным детоксифицирующим компонентом таких систем, а эффективное использование фермента в биотехнологических процессах должно базироваться на данных о его структурной организации и механизме действия. Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение деградации гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами. Установить механизм окисления атразина лакказой в присутствии редоксмедиатора. Глава 1. Триазиновые пестициды относятся к классу гетероциклических соединений, содержащих в своей основе шестичленный ароматический цикл с тремя атомами азота. Триазины впервые синтезированы в конце XIX века. Это довольно многочисленная группа веществ, имеющих разнообразную практическую значимость. Основной практический интерес представляет группа симметричных триазинов симтриазинов, которые содержат атомы азота в положениях 1, 3 и 5 ароматического кольца. Симтриазины образуются в реакции взаимодействия трихлорпиануровой кислоты с соответствующими интермедиатами. Два из трех атомов хлора в кислоте легко замещаются другими группами. Третий атом хлора является менее лабильным и может замещаться на метилтио или метоксигруппу. Симтриазины используются как пестициды, отбеливатели, красители, дезинфектанты и взрывчатые вещества Мельников и др. Микробная деградация пестицидов , С. А. и др. А. и др. В качестве пестицидов симтриазины преимущественно применяются для борьбы с сорными растениями гербициды, хотя описаны также фунгицидные и инсектицидные свойства представителей этой группы соединений. Синтетические симтриазины начали применять как гербициды в середине х годов . XX века. В этом качестве преимущественно используются симтриазины со структурой Рис. Рисунок 1. Соединения 1, содержащие при экзоциклическом азоте алифатический радикал, недостаточно стабильны и практического применения не нашли. При замещении этого алифатического радикала ароматическим уменьшается фитоцидность и возрастает фунгицидная активность соединения. Наиболее активен 2,4дихлорхлорфениламино1,3,5триазин анилазин, который в небольших масштабах используется для борьбы с болезнями растений. Соединения 2 проявляют высокую гербицидную активность в том случае, если углеводородные радикалы при экзоциклическом азоте имеют не более 4х атомов углерода. Аналогичная закономерность наблюдается и в ряду соединений структуры 3. Замена атома галогена на гидроксил приводит к полной потере гербицидной активности, а при замене галогена на алкоксил 4 или алкилтиогруппу 5 изменяется избирательность действия с сохранением гербицидных свойств. Оптимальная активность проявляется у соединений этого ряда, содержащих в алкокси или алкилтиогруппе один
атом углерода, хотя имеются сообщения о наличии гербицидных свойств у соединений с более длинным углеродным скелетом 2. Введение вместо галогена 2хлоралкилтио, бензилтио или бензилоксигрупп приводит к снижению фитоцидности и появлению фунгицидных свойств. В качестве гербицидов избирательного действия предложены 2алкилокси, 2алкилтио, 2галоген, 2циан, 2алкил4циклоалкил6алкил1,3,5триазины. Гербицидную активность проявляют диамино1,3,5триазины, содержащие при экзоциклическом азоте вторичные, третичные, непредельные и другие углеводородные радикалы, как незамещенные, так и с различными заместителями циан, метокси и другие группы. В качестве гербицидов запатентовано большое количество замещенных триазинов. Таблица 1 суммирует сведения о наиболее широко используемых триазиновых пестицидах Мельников . По масштабам производства и потребления симтриазины одна из ведущих групп пестицидов, причем лидирующее положение занимает атразин 2хлор4этиламино6изопропиламино1,3,5триазин М. Каспаров В. А. и др. Объем мирового производства атразина превышает 0 тонн в год i . Атразин включен в список контролируемых пестицидов в странах Европейского Сообщества i . Таблица 1. Название препарата Растворимость в воле, мгл ЛД млеко ИТ.