Исследование процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ

• Автор: Мезенцев, Юрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Бактериальные Ьаспарагиназы

1.1.1. Строение, активный центр, механизм действия и субстратная специфичность

1.1.2. Влияние и температуры на кинетические параметры бактериальных Ьаспарагиназ

1.1.3. Бактериальные Ьаспарагиназы в медицине

1.1.4. Модифицированные формы Баспарагиназы

1.2. Белокбелковыс взаимодействия

1.2.1. Классификация белокбелковых взаимодействий

1.2.2. Характеристика интерфейса в белокбелковом комплексе

1.2.3. Методы исследования белокбелковых взаимодействий

1.2.4. Белокбелковые взаимодействия как мишени для разработки новых лекарственных средств
1.3. Оптический биосенсор В1асоге
1.3.1. Поверхностный плазмонный резонанс
1.3.2. Оптический биосенсор В1асоге в приложении к
исследованию белокбелковых взаимодействий
1.4. Биоинформатика
1.4.1. Виртуальное аланиновое сканирование
1.4.2. i
2. Материалы и ме тоды
2.1. Экспериментальная часть
2.1.1. Реагенты
2.1.2. Эксперименты по изучению процесса
олигомеризации аспарагиназы . v
2.1.3. Иммобилизация аспарагиназы . v на поверхности оптического чипа СМ
2.1.4. Эксперименты по изучению специфичности процесса олигомеризации бактериальных аспарагиназ
2.2. Биоинформационная часть
2.2.1. Исходные данные для молекулярного
моделирования
2.2.2. Использованное программное обеспечение
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Иммобилизация аспарагиназы из . v и мониторинг процессов се диссоциации и олигомеризации
3.2. Моделирование аспарагиназы из . v
3.3. Анализ поверхности тетрамеров аспарагиназы для предсказания ориентации тетрамеров фермента на поверхности чипа
3.4. Оценка площади поверхности интерфейса между димерами аспарагиназы . i и . v
3.5. Оценка энергии взаимодействия между димерами АС и , а также между субъединицами в этих димерах . i и . v
3.6. Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между димерами АС и в тетрамере аспарагиназы . v
3.7. Экспериментальная оценка специфичности процесса олигомеризации бактериальных аспарагиназ
3.8. Построение трехмерных моделей аспарагиназ из . i и . i 5 и их оптимизация
3.9. Построение трехмерной модели химерных тетрамеров аспарагиназ и их оптимизация
3 Оценка энергии взаимодействия между субъединицей А и тримером в полученных моделях химерных тетрамеров аспарагиназ
3 Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицей А и тримером в химерных тетрамерах аспарагиназ и их диких формах
4 Выводы
5 Литература
Список сокращений
ББВ белокбелковыс взаимодействия
ПЛР поверхностный плазмонный резонанс
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
i
ЯМР ядерный магнитный резонанс
V Vi ii
i
i
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
i i
1этилдиметиламинопропилкарбодиимид
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
Ы2гидроксиэтилпиперазинЬГэтан сульфоновая кислота
1 I гидроксисукцинимид
i
среднеквадратичное отклонение
Введение


На сегодняшний день существует множество доступных методов, с помощью которых возможно исследование белокбелковых взаимодействий и, в частности, олигомеризации мультисубъединичных белков. Многие экспериментальные подходы позволяют регистрировать белокбелковые взаимодействия в широком диапазоне концентраций, однако не все дают возможность оценивать стехиометрию образующихся комплексов. Существуют также биоинформационные подходы, позволяющие предсказывать возможность белокбелковых взаимодействий, оценивать устойчивость образующихся белковых комплексов, определять специфические контактные участки в бслокбелковых взаимодействиях и т. Совместное использование экспериментальных и биоинформационных методов дает возможность более эффективно решать различные задачи, направленные на исследование белокбелковых взаимодействий и, в частности, процесса олигомеризации мультисубъединичных белков. Цель работы состояла в определении молекулярных основ и специфичности белокбелковых взаимодействий при олигомеризации бактериальных асиарагиназ. Построить модели пространственных структур аспарагиназ . Выполнить сравнительный молекулярнографический анализ области контакта между субъединицами для аспарагиназ из ii v и v. Разработать методику иммобилизации, диссоциации и восстановления олигомерной структуры бактериальных аспарагиназ на поверхности оптического чипа для экспериментального изучения олигомеризации данных ферментов с помощью технологии оптического биосенсора. Оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных аспарагиназ с помощью оптического биосенсора i . Впервые был исследован процесс олигомеризации бактериальных аспарагиназ с помощью комбинации методов молекулярного моделирования и технологии оптического биосенсора. Были построены модели тетрамеров аспарагиназ из И. И. i 5, для которых на данный момент отсутствуют кристаллографические данные. Для аспарагиназ из Е. Результаты, полученные в работе, могут служить основой для разработки модифицированных форм аспарагиназы. С одной стороны, тетрамеры модифицированных аспарагиназ могут быть более устойчивыми в плазме крови человека, что означает пролонгированное действие препарата, и, как следствие, позволяет снижать его лечебные дозы, вводимые пациентам. С другой стороны, разработка новых препаратов аспарагиназ может идти по пути снижения молекулярного веса активной формы этого белка, т. Разработанная методика иммобилизации и мониторинга процессов диссоциации и олигомеризации бактериальных аспаргиназ в дальнейшем может быть успешно использована в работах с другими олигомерными белками. Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной школеконференции молодых ученых Системная биология и биоинженерия Москва, , на V Международной конференции iii i Новосибирск, , на научной конференции ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН Москва, . По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Диссертационная работа состоит из введения, 4х глав обзора литературы, главы Материалы и методы, и глав раздела Результаты и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 2 источника. Работа изложена на 1 странице текста, содержит рисунка и таблиц. Исследование выполнено на базе ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке РФФИ гранты 5 и 5. Бактериальные Баспарагиназы относятся к классу амидогидролаз, которые катализируют гидролитическое расщепление амидной связи субстрата. В качестве субстрата для Баспарагиназы выступает преимущественно Баспарагин, гидролиз которого сопровождается образованием свободного Баспартага и аммиака рис. Рисунок Б Схематическое уравнение реакции гидролитического расщепления Баспарагина Баспарагиназой. Аспарагин и аспартаг играют важную роль в ряде метаболических процессов всех живых организмов от бактерий до млекопитающих. У растений Баспарагин является главной формой хранения и транспортировки аминного азота, необходимого для биосинтетических реакций , 8, , 8. У млекопитающих, в частности в организме человека, Баспартат участвует в цикле мочевины как предшественник орнитина, а также в реакции трансаминирования с образованием оксалоацетата в процессе глюконеогенеза.