Исследование конформации ингибиторов протеиназ, выделенных из фасоли и картофеля, методами КД-спектроскопии и модификации функциональных групп

• Автор: Дронова, Лидия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 174 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. КОНФОШАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ.II

1.1. Принципы организации и стабилизации структуры . II

1.2. Круговой дихроизм.

1.2.1. Определение вторичной структуры из спектров КД.

1.2.2. Спектры ВД в ближней УФобласти .

2. КРУГОВОЙ ДИХРОИЗМ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

С ПРОТЕИНАЗАМИ.

2.1. Вторичная структура.

2.2. Третичная структура.
2.3. Свойства комплекса ингибиторпротеиназа
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы.
2. Спектрофотометрические измерения
2.1. Спектры КД и спектры поглощения.
2.2. Собственная флуоресценция.
2.3. Флуоресценция зонда.
3. Гельхроматография
4. Седиментационный анализ.
5. Электрофорез в полиакриламидном геле
6. Изоэлектрофокусирование в геле
7. Диссоциация комплекса ферментингибитор .
8. Ограниченный протеолиз
9. Восстановление дисульфидных связей
. Определение содержания сульфгидрильных групп. .
. Модификация остатков лизина
. Модификация остатков аргинина
. Модификация остатков тирозина
. Определение ингибиторной активности
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ ИЗ ФАСОЛИ И КАРТОФЕЛЯ.
1.1. Конформация нативных молекул ингибиторов
1.2. Влияние денатурирующих агентов на конформацию ингибитора из фасоли .
1.3. Влияние денатурирующих агентов на конформацию ингибитора из картофеля
1.4. Флуоресцентные свойства ингибиторов.
2. ОСОБЕННОСТИ КОНФОГМАЦИОННЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ФЕШЕНТИНГИБЙТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ.
2.1. Взаимодействие химотрипсина с нативными ингибиторами из фасоли и картофеля.
2.2. Взаимодействие химотрипсина с ингибитором из картофеля, модифицированным с помощью ограниченного протеолиза.
2.3. Связывание флуоресцентного зонда с комплексом химотрипсинингибитор из картофеля
3. ПРИРОДА КОМПЛЕКСОВ ИНГИШТОРА ИЗ КАРТОФЕЛЯ С ПРОТЕИНАЗАМИ.ИО
3.1. Физикохимическая характеристика . III
3.2. Стехиометрия взаимодействия
3.3. О взаимосвязи структуры и функции.И
4. ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП ИНГИБИТОРА ИЗ КАРТОФЕЛЯ НА ЕГО КОНФОРМАЦИЮ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БРОШНАЗАМИ
4.1. Восстановление дисульфидных связей
4.2. Модификация остатков основных аминокислот аргинина и лизина.
4.3. Модификация остатков тирозина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА


Вовторых, было установлено, что пептидная связь госо имеет планарную трансконфигурацию. И наконец, было показано, что для соединений пептиднобелковой природы характерно наличие определенных упорядоченных пространственных структур, реализуемых в соответствующих условиях. Термин вторичная структура объединяет все типы упорядоченных структур, встречающиеся в белках. Наиболее известными из них являются Хспираль, и структура. В модели хспирали, предложенной Полингом и Кори 8, на один виток цриходится 3,6 аминокислотных остатка. Средняя длина спирального участка в нативной глобуле составляет остатков . Форма сХспирали такой длины близка к сферической, спираль стабилизуется водородными связями, связывающими каждую группу СО с группой ГО, четвертой по счету от нее мономерной единицы. Такая система водородных связей придает хспирали особую устойчивость и поэтому х спираль характизуется весьма плотной внутримолекулярной упаковкой без какихлибо пустот. Кроме спирали экспериментально было доказано существование спирали 0 7. Теоретически возможны и другие способы спиральной упаковки полипептидной цепи, однако из всех возможных форм Xспираль является наиболее стабильной, так как обеспечивает образование максимального числа водородных связей и внутримолекулярных контактов, особенно между гидрофобными группами. Другими элементами вторичной структуры являются Способность к образованию вторичной структуры тесно связана с полярностью боковой игруппы почти все гидрофобные остатки стабилизуют с и структуру, а почти все короткие гидрофильные и все заряженные остатки а также глицин и пролин дестабилизуют как так и структуру остатки же, состоящие из длинной гидрофобной цепи и полярной, но незаряженной головки занимают промежуточное положение. Например, полилизин образует спираль цри ,0, когда его группы не несут никакого заряда. Бэлиглицин также способен образовывать спираль, но в большей степени он стремится принять конформацию, при которой цепь находится в относительно растянутом состоянии. Тип вторичной структуры, образованной в каждом гидрофобном участке цепи, определяется природой входящих в него гидрофобных групп и их распределением в цепи. Если в цепи гидрофобные группы занимают положение 13, то образуется преимущественно оформа. Способности аминокислотных остатков к образованию структуры значительно более специфичны, чем их способности к образованию спиралей. Известно, что остатки ароматических аминокислот имеют тенденцию встраиваться в . Кроме с. Венкатачалам первый охарактеризовал возможных типов изгибов в глобулярных белках 1. Льюис и соавт. Сысвязь и ССсвязь. В отличие от сспиральных и структурных участков, состоящих главным образом из остатков гидрофобных аминокислот, соединяющие их изгибы и петли, обогащены короткими полярными группами, заряженными группами, глицинами и пролинами, поэтому изгибы называют факторами инициации и терминации спирали и слоя . Нараду с регулярными структурами полипептидная цепь включает участки гибкой, изменяющейся, статистически неупорядоченной структуры, называемой иначе беспорядочным клубком. Например, полилизин при 5,7 принимает конфигурацию беспорядочного клубка. Третичная структура характеризует способ сворачивания полипептидной цепи, содержащей регулярные и нерегулярные участки, в компактную глобулу. За последнее время методом рентгеноструктурного анализа изучена тонкая структура около 0 различных белков. Результаты этих исследований показывают, что для трехмерной структуры белков нет какогото единого архитектурного принципа. Однако некоторые общие черты аминокислотной последовательности, ответственные за те или иные характеристики пространственных структур белковой молекулы всетаки удалось выявить. Установлено, что все полярные ягруппы аминокислотных остатков расположены на внешней поверхности молекулы и находятся в гидратированном состоянии. Почти все неполярные ягрушзы локализованы в глубине молекулы, образуя так называемое гидрофобное ядро.