Исследование дезоксирибонуклеаз лимфоцитов периферической крови человека при бронхиальной астме

• Автор: Мбайнаджи Лодум
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 132 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунологические механизмы воспаления бронхов и легких

1.1.1. Клетки участники воспаления легких

1.2. Два типа клеточной гибели некроз и апоптоз

1.3. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний

1.3.1. Физиологические факторы,

приводящие к гибели клетки

1.3.2. Роль протеолиза в развитии апоптоза

1.3.3. Апоитозспецифическая фрагментация ДНК

1.4. Роль нуклеаз в апоптозе
1.4.1. Структурные изменения хроматина 3
1.4.2. Ядерные дезоксирибонуклеазы
1.4.3. Апоптотические Са2 ,М2зависимые
эндонуклеазы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
2.2. Объект исследования
2.3. Выделение клеток периферической крови
2.3.1 .Оценка жизнеспособности клеток
2.3.2. Определение апоптоза
2.4. Получение кольцевой ДНК
2.4.1. Очистка ДНК рВЯ 2
2.5. Получение дезоксирибонуклеопротеида лимфоцитов
2.6. Определение разрывов в ДНК лейкоцитов
2.7. Определение активности ферментов
по приросту кислоторастворимых продуктов ДНК
2.8. Флуорометический метод определения эндонуклеаз
2.9. Определение активности РНКазы
2 Аналитические методы
2 Гидролиз суперскрученной ДНК рВЯ
ДНКазами лимфоцитов
2 Количественная оценка продуктов гидролиза ДНК ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Определение однонитевых разрывов в ДНК лейкоцитов
3.2. Выделение лимфоцитов
3.3. Фракционирование белков лимфоцитов
3.3.1. Определение ДНКазной активности
белковых фракций
3.4. Выделение плазмидной ДНК
3.4.1. Амплификация ДНК плазмид
3.4.2. Хроматография ДНК плазмиды на сефарозе 4В
3.5. Изучение ДНКазной активности в клетках лимфоцитов
3.5.1. Изучение энзиматической активности белков цитоплазмы и хроматина в присутствии
ионов двухвалентных металлов
3.5.2. Изменение активности ДНКаз хроматина
у больных бронхиальной астмой
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Активированные воспалительные СД 4 Тлимфоциты выполняют свою эффекторную функцию путем активации макрофагов, усиливая их способность убивать фагоцитированные бактерии. Однако активация макрофагов придает им способность убивать не только внеклеточные бактерии, но и другие внеклеточные мишени, например, опухолевые клетки организма. В результате повреждения здоровых тканей может развиваться иммунное воспаление, которое характеризуется образованием гранулем. В центре гранулемы сконцентрированы макрофаги, которые окружены активированными Тлимфоцитами и представлены ТН1 и ТН2 клонами. Клетки легкого внутри гранулемы могут погибать как от недостатка кислорода, так и от цитотоксических продуктов самих макрофагов и Тлимфоцитов. Таким образом, иммунное воспаление, которое направлено на ограничение очага инфекции, может вызвать повреждение тканей организма. В норме клеткам, мигрировавшим в ткани, отведен строго определенный срок жизни, по истечении которого они подвергаются элиминации в результате запуска программированной клеточной гибели апоптозу , , При хронических атопических заболеваниях наблюдается нарушение элиминации клеток из легких вследствие нарушения апоптоза i . Естественные киллеры ЕК. Естественные киллеры представляют собой субпопуляцию лимфоцитов, происходящих из костномозговых предшественников. Они характеризуются наличием больших гранул в цитоплазме, поэтому имеют второе название большие гранулярные лимфоциты. Их основная функция убивать некоторые опухолевые клетки. ЕК развиваю тся независимо от Т и Влимфоцитов и не несут характерных для Т и Влимфоцитов поверхностных маркеров. За последние годы показано, что ЕК могут продуцировать иммунорегуляторные цитокины. Они обладают способностью лизировать клетки, инфицированные микроорганизмами, и ингибировать размножение микроорганизмов. Как правило, ЕК циркулируют в крови, но при воспалении или развитии вирусной инфекции в легких они могут мигрировать в легочную ткань i . Нейтрофилы. В отсутствии воспалительного процесса нейтрофилы находятся, в основном, в кровеносном русле, где они составляют большую часть циркулирующих лейкоцитов. При воспалении происходит быстрое массивное перераспределение нейтрофилов в поврежденные ткани. Этот процесс имеет важное значение для развития патологического процесса в легких, где транзит нейтрофилов облегчен благодаря тонкослойному барьеру, отделяющему альвеолы от. Маянский, . Нейтрофилы рассматриваются как основные эффекторные клетки при остром воспалении. Факторы секреции нейтрофилов преимущественно накапливаются в лизосомальных гранулах. Продукты секреции нейтрофилов содержат большой набор ферментов и белковых факторов обладающих бактерицидной активностью это лизоцим, лактоферин, катепсин в, дефепсины, катионный антимикробный белок, бактерицидный белок В1Р. Кроме того, гранулы нейтрофилов содержат протеолитические ферменты, активные по отношению компонентов интерстициальной ткани. Это прежде всего эластаза или нейтральная сериновая протеаза, коллагеназа, гепариназа, желатиназа. В легких именно эластаза нейтрофилов участвует в патогенезе деструктивных заболеваний таких как эмфизема, ХОБЛ, астма, оказывая влияние на функциональную активность эпителиальных клеток, повышает секрецию слизи в бронхах, подавляет функцию реснитчатого эпителия. Для нормального функционирования легких очень важно наличие механизмов, ингибирующих активность нейтрофилов, которые обязаны сдерживать неадекватную, продолжительную активацию нейтрофилов, приводящую к повреждению ткани. Поэтому наряду с образованием нейтрофилов крайне важным для организма является процесс удаления этих клеток из тканей и кровотока. Следует подчеркнуть, что основными источниками хемотаксических факторов для нейтрофилов являются лимфоциты, тучные клетки, эозинофилы, которые играют важную роль в патогенезе ХОБЛ. Эозинофилы. Эозинофилы встречаются в периферической крови человека значительно реже, чем нейтрофилы 2,5 от общего числа лейкоцитов. На мазках крови они имеют размер несколько больший, чем у нейтрофилов мкм в диаметре. Цитоплазма эозинофилов слабо базофильна.