Анализ связывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами

• Автор: Дмитриев, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о биспецифических антителах

2.1.1. История создания биспецифических антител и области их применения

2.1.2. Способы получения биспецифических моноклональных антител

2.1.3. Тестирование биспецифических моноклональных антител

2.1.4. Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах

2.1.5. Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител

2.1.6. Применение бисиецифических моноклональных антител в твердофазных методах

2.2. Принцип работы и устройство биосенсора ГАзуэ
3. ПРИЛОЖЕНИЕ
3.1. Теоретические основы анализа связывания антител с антигенОхМ
3.1.1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе
3.1.2. Анализ равновесного связывания антител с
антигеном, иммобилизованным на твердой фазе
3.1.3. Модель бивалентного связывания антител с
антигеном, иммобилизованным на твердой фазе
3.1.4. Использование бивалентной модели для предсказания
теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации Ка в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
3.1.5. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания антител с иммобилизованным антигеном
3.1.6. Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител
3.1.7. Кинетический анализ связывания антител с
антигеном, иммобилизованным на твердой фазе
3.1.8. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемых кинетических констант в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
3.2. Заключение
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Реагенты и оборудование
4.2. Методы исследований
4.2.1. Клеточные линии
4.2.2. Приготовление аффинных носителей
4.2.3. Аффинная очистка моноспецифических антител
4.2.4. Аффинная очистка биспецифических антител
4.2.5. Определение концентрации белка
4.2.6. Определение антипероксидазной активности антител
4.2.7. Определение антигенсвязывающей активности антител
4.2.8. Определение активности биспецифических антител иммуноферментным методом с двумя антигенами
4.2.9. Анализ связывания антител с адсорбированными на
твердой фазе антигенами иммуноферментным методом
4.2 Приготовление антител, меченых 1, и их очистка
4.2 Определение концентрации меченых 1 антител после аффинной очистки
4.2 Анализ связывания Iмеченых антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе
4.2 Анализ связывания и определение наблюдаемой равновесной константы ассоциации антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом
4.2 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия
4.3. Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью биосенсора I
4.3.1. Иммобилизация антигенов и на поверхность кюветы биосенсора I
4.3.2. Тестирование условий распада иммунологического комплекса
4.3.3. Кинетика взаимодействия антител с иммобилизованными и
4.3.4. Обработка, преобразование и анализ кинетических кривых, получаемых с помощью биосенсора I
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Изучение связывания родительских и биспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом
5.2. Изучение связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом
5.3. Анализ параметров связывания антител с
иммобилизованными антигенами с помощью оптического
биосенсора
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости мстить МКА . Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах 8. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, но и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами. Рисунок 2. Возможная структура комплексов при связывании антител и фрагментов с иммобилизованным антигеном, а Моновалентное связывание моноспецифических антител б бивалентное связывание моноспецифических антител в моновалентное связывание биспецифичсских антител г моновалентное связывание фрагментов. С иммобилизованным антигеном МКА класса I могут связываться как одним антигенсвязывающим сайтом, моновалентно рис. БИАТ класса I представляют собой моновалентные молекулы в отношении каждого из антигенов рис. При использовании МКА в иммуногистохимии, иммуноблотгинге, иммуноферментном анализе ИФА и других твердофазных системах необходима количественная оценка процесса связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпитопу антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антигенантитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител например, класса I бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе . Изза стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары антителоантиген, но и для каждого клона антител к данному антигену . Ранее бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном доказывали и изучали путем сравнения нативных антител и их фрагментов относительно небольших фрагментов антител, которые включают антигенсвязывающий сайт и образуются в результате обработки антител папаином. Сравнительный анализ связывания с иммобилизованным
антигеном нативных антител и их фрагментов является классической иммунологической моделью для апробации новых методов исследования , . Следует отметить, что упомянутое сравнение не является достаточно полноценным. Несовершенство подобного сравнения заключается в том, что структура фрагментов отлична от структуры нативных молекул антител. Имеются данные, что участок может иметь значение для антигенсвязывающей способности антител например, он может влиять на гибкость молекулы . С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе . При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе например, на поверхности иммунного планшета часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства , . Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура полумолекул БИАТ тождественна структуре полумолекул нативных родительских антител рис. И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител в том случае, когда обе полумолекулы БИАТ относятся к одному подклассу I 2, 3, , . Цели и задачи исследования.