Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)

• Автор: Рыжакова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Оглавление2

Список сокращений

Введение6

Глава I Обзор литературы9

1.1. Общая характеристика ММП.9

1.2. Структура ММП.

1.3. Характеристика основных подсемейств ММ

1.3.1. Коллагеназы

1.3.2. Желатиназы

1.3.3. Стромелизины.

1.3.4. Матрилизины

1.3.5. Мембраносвязанные ММП.
1.3.6. Неклассифицированные ММП
1.4. Рефляция активности ММП
1.4.1. Регуляция транскрипции
1.4.2. Активация проММП
1.4.3. Эндогенные тканевые ингибиторы ММП ТИМП
1.5. Роль ММП в опухолевой препрессии
1.5.1. ММР1 или коллагеназа1 интерстициальная коллагеназа в прогрессии опухоли
1.5.2. МТ1ММР мембраносвязанная ММП в клеточной инвазии
1.5.3. Роль коллагеназы 3 ММР в прогрессии опухоли
1.5.4. ММР8 коллагеназа 2 коллагеназа нейтрофилов в прогрессии опухоли .
1.6. Некоторые регуляторные функции ММП
Глава II Материалы и методы исследования
.1. Использованные материалы
.1.1. Список использованных реактивов
И. 1.2. Клеточные линии.
.1.3. Клинический материал
И.2. Методы исследования.
П.2.1. Одновременное выделение ДНК и РНК 1уанидинизотиоцианатным
методом
И.2.2. Реакция обратной транскрипции РНК.
.2.3. Исследование экспрессии генов
Н.2.3.1 Полимеразная ценная реакция КТРСК
П.2.3.2. Электрофорез в агарозном геле
П.2.4. Определение коллагенолитической активности
II.2.4.1. Выделение коллагена из кожи крыс
Н.2.4.2. Определение концентрации коллагена но содержанию оксипролина.
П.2.4.3. Получение меченного флуоресцсинизотиоцианатом коллагена.
Н.2.4.4.Определение коллагенолитической активности
П.2.5. Идентификация коллагеназ IV типа, с помощью метода зимографии
П.2.6. Иммуношстохимическое исследование
Глава Ш Результаты исследования и их обсуждение
Ш.1. Сравнительное исследование экспрессии ММП1. МТ1ММП
ТИМП1 и уДП на модели Ьибробластов крысы
Ш.1.1. Экспрессия генов ММП1, МТ1ММП, ТИМП1 и уА
П1.1.2. Исследование коллагенолитической активности ММП
II 1.2. Сравнительное исследование экспрессии ММП1. ММГ12 МТ1ММП. уЛП. ТИМП1.2 в коммерческих клеточных линиях карцином шейки матки человека, ассоциированных с НРУ и ПРУ. Ш.2.1. Экспрессия генов ММП1, ММП2, МТ1ММП и эндогенных
регуляторов их активности
Ш.2.2. Сравнительное исследование коллагенолитической активности.
ИВ. Исследование экспрессии ММП1. МТ1ММГ1. ММП2. ММГ1
уЛП. ТИМП1. ТИМП2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки.
Ш.3.1. Эспрессия генов ММП1, МТ1ММП, ММП2, ММГ19,
уАП, ТИМП1 и ТИМП2 в плоскоклсточных карциномах шебки матки
Ш.3.2. Исследование коллагенолитической активности.
III Исследование ММП2, ММП9 методом зимографии.
II 1.3.4. Иммуногистохимическое исследование
Выводы
Список опубликованных работ по теме диссертации
Список литературы


Тканевые коллагеназы ММП1, ММП8, ММП, наряду с жслатиназами ММН2, ММП9, относятся к ММП и играют решающую роль в развитии этих процессов, поскольку они специфически гидролизуют белки группы коллагена одного из основных компонентов СТМ. Коллагеназы, и в частности интерстициальная коллагеназа ММП1, специфически гидролизуют фибрилярные коллагены I, II, III, V и IX типов 2, которые составляют от общего белка организма человека. Нативные фибриллярные коллагены устойчивы к действию протсолитических ферментов. ММП1 специфически запускает гидролиз фибриллярных коллагенов, при этом она гидролизует всего одну связь в молекуле этого белка, находящуюся на расстоянии л длины молекулы от Сконца. Образующиеся фрагменты способны денатурировать в физиологических условиях и далее подвергаться действию широкого спектра иротеиназ, тем самым ММП1 обеснечиваег развитие деструктивного процесса 2. Желатиназы гидролизуют коллаген IV типа основу базальных мембран 3. Этим двум группам ферментов принадлежит ключевая роль в разрушении соединительнотканного барьера при развитии инвазивного онкологического процесса. В настоящее время интенсивно исследуются вопросы, связанные с экспрессией ММП при онкогенной трансформации. Нами было исследовано влияние гена Е7 вируса папиллом человека типа V на экспрессию ММП и их эндогенных регуляторов. Вирусы папиллом V высокого риска V и V являются этиологическими факторами возникновения рака шейки матки 4, 5, 6. Эти типы V являются наиболее агрессивными и широко распространенными. За открытие ключевой роли вируса V в возникновении рака шейки матки доктору Харольду цур Хаузену в году была присуждена Нобелевская премия. В настоящее время созданы вакцины против онкогенных вирусов папиллом человека, которые в ряде стран уже используются для предотвращения рака шейки матки. По статистическим данным в мире регистрируется до 0 тысяч новых случаев рака шейки матки, а женщины развивающихся стран подвержены этому заболеванию в раз больше, чем остальные. Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности от рака у женщин. Установлено, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7 4, 5, 6. У больных раком шейки матки обнаруживаются транскрипты генов Е6 и Е7 в биопсийном материале. Однако функциональный потенциал генов Е6 и Е7 остается недостаточно изученным. Гак недостаточно исследовано изменение протеолитического потенциала клеток и тканей, в частности интерстициальной коллагеназы, при трансформации их этим вирусом, что может служить важным маркером инвазивного процесса. Настоящая работа является продолжением и частью исследований, проводимых в лаборатории биохимии и химической патологии белков ГУ НИИ БМХ РАМН и направленных на выяснение роли ММП в многоступенчатом процессе канцерогенеза. Целыо настоящего исследования является выяснение особенностей экспрессии интерстициальной коллагеназы ММП1, эндогенных регуляторов ее активности, как факторов инвазии, при онкогенной трансформации фибробластов геном Е7 V. Провести сравнительные исследования экспрессии ММ11 , и эндогенных рсуляторов е активности тканевого ингибитора ММГ ТИМП1 и активатора плазминогена уракиназного типа уАП на фибробластах крысы, иммортализованных геном вируса полиомы и трансформированных геном Е7 V. Исследования провести на уровне мРНК и белка. На коммерческих клеточных линиях, полученных из опухолей шейки матки женщин i, i, i, С41, а также линии клеток СЗЗА, не содержащей копий V, провести сравнительные исследования экспрессии ММП1, ММП и ММП2 ММП9 как двух групп ферментов, отвечающих за развитии инвазивного процесса, а также регуляторов их активности ТИМП1, ТИМП2 и уАП на уровне мРНК и энзимологическом уровне. Исследовать экспрессию ММП1, II2, ММП9 и МТ1ММП, а также ТИМП1, ТИМП2 и уАП на операционных образцах плоскоклеточных карцином шейки матки, ассоциированных с геном Е7 V с использованием и методами иммуногистохимии и энзимологии.