Ингибирование экспрессии онкогенов семейства myc и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью двуцепочечных интерферирующих РНК

• Автор: Кабилова, Татьяна Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Введение

Глава 1. Онкогены семейства туе как терапевтические мишени

обзор литературы

1.1. Транскрипционные факторы семейства Мус.

1.1.1. Биологические функции Мус.

1.1.2. Структура белков семейства Мус

1.1.3. Регуляция транскрипции белками семейства МУС

1.1.3.1. Мус и Мах структура и функции

1.1.3.2. Механизмы Мусзависимой активации транскрипции

1.1.3.3. Механизмы Муозависимой репрессии транскрипции

1.1.3.4. Регуляция функции Мус и Мусиндуцируемый онкогенез

1.1.4. МУС как терапевтическая мишень
1.1.4.1. Блокирование взаимодействий Мус с Мах.
1.1.4.2. Экспрессия токсинов под контролем Мусрегулируемых промоторов
1.1.4.3. Ингибирование экспрессии Мус
1.1.4.3.1. Антигенный подход
Триплексформирующие олигонуклеотиды.
Соединения, стабилизирующие образование втетраплексов.
1.1.4.3.2. Антисмысловой подход.
1.1.4.3.3. Рибозимы.
1.1.4.3.4. РНКинтерференция и микроРНК.
Использование феномена РНКинтерференции в
молекулярной биологии
Специфичность действия интерферирующих РНК.
Ингибирование экспрессии генов семейства туе
с помощью интерферирующих РНК
1.2. Длинные дцРНК как противоопухолевые агенты.
1.2.1. Неспецифический клеточный ответ на двуцепочечную РНК
1.2.1.1. ДцРНКзависимая протеинкиназа И.
1.2.1.2. Олигоаденилатсинтетаза и РНКаза
1.2.1.3. Топодобныв рецепторы.
1.2.1.4. Интерфероны.
1.2.2. Потенциал интерферонового ответа в противоопухолевой терапии
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.1.1. Реактивы и препараты.
2.1.2. Линии клеток.
2.1.3. Олигонуклеотиды
2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе.
2.2. Методы
2.2.1. Ферментативный синтез i
2.2.1.1. Получение дцДНКматриц в реакции с фрагментом Кленова.
2.2.1.2. I vi транскрипция.
2.2.1.3. Выделение i vi транскриптов.
2.2.1.4. Гибридизация РНКтранскриптов и гидролиз РНКазой Т1
2.2.2. Введение Рметки по Зконцу РНК.
2.2.3. Статистическое расщепление олигорибонуклеотидов ЕхЗ
и ЕхЗ 2 М имидазолом.
2.2.4. Гибридизация химически синтезированных олигорибонуклеотидов
2.2.5. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.6. Ферментативный синтез длинной дцРНК
2.2.6.1. Обратная транскрипция.
.6.2. Амплификация фрагментов генов стус и .
2.2.6.3. I vi транскрипция.
2.2.6.4. Гибридизация РНКтранскриптов и очистка целевых дцРНК
2.2.7. Клеточные культуры и трансфекция.
2.2.8. Измерение уровня экспрессии генов методом ОТПЦР.
2.2.8.1. Обратная транскрипция.
2.2. ПЦР.
2.2. в. 3. ПЦР в режиме реального времени
2.2 Вестерн блот анализ
2.2 Определение количества живых клеток МТТтест
2.2 Определение эффективности накопления i в клетках
2 Введение остатка флуоресцеина в i
2 Анализ проникновения i в клетки
2.2 Электрофорез
2 Электрофорез в ПААГ
2 Электрофорез в агарозном геле
2.2 Статистика
Глава 3. Ингибирование экспрессии онкогенов семейства туе и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью
двуцепочечных интерферирующих РНК результаты и обсуждение
3.1. Результаты
3.1.1. РНК как ингибиторы экспрессии генов семейства туе.
3.1.1.1. Выбор последовательностей вРНК.
3.1.1.2. Получение РНК
3.1.1.3. Подавление экспрессии генов семейства туе
с помощью РНК.
3.1.1.3.1. Подавление экспрессии гена стус с помощью
аРНК в клетках КВ и КЫМС.
Проникновение меченной флуорвецвином ЯРНК
зЕхЗ в клеточные линии разного происхождения
3.1.1.3.2. Подавление экспрессии гена Ытус с помощью
вРНК ыЕх2 в клетках МИ.
3.1.1.4. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ
и нейробластом ЭКЫМС и IМИ с помощью в1РНК.
3.1.2. Длинные дцРНК как неспецифические ингибиторы экспрессии
генов семейства туе и пролиферации раковых клеток человека
3.1.2.1. Получение длинных дцРНК,
3.1.2.2. Подавление экспрессии гена стус с помощью длинных дцРНК
в клетках карциномы КВ и нейробластомы 5КЫМС
3.1.2.3. Ингибирование пролиферации клеток карциномы КВ и нейробластом вКЫМС и МИ с помощью длинных дцРНК.
3.1.3. Динамика изменения экспрессии геновмаркеров интерферонового ответа под действием з1РНК и длинных дцРНК в раковых клетках человека
3.1.3.1. Изменение уровня экспрессии генов ОА1 и РКИ под действием коротких э1РНК и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ
и нейробластомы ЭКЫМС
3.1.3.2. Изменение уровня экспрессии 3актина под действием коротких вРНК и длинных дцРНК в клетках карциномы КВ и нейробластомы БКЫМС.
3.2. Обсуждение результатов
3.2.1. Специфическое подавление экспрессии генов стус и Ытус
и пролиферации опухолевых клеток человека с помощью Б1РНК
3.2.2. Неспецифическое подавление экспрессии гена стус и пролиферации раковых клеток человека с помощью РНК и длинных дцРНК.
3.2.3. Синергическое подавление экспрессии гена стус препаратом
1Мус по специфическому и неспецифическому механизмам.
3.2.4. Изменение уровня экспрессии геновмаркеров интерферонового
ответа под действием аРНК и протяженных дцРНК.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Злокачественное перерождение клеток может происходить в результате амплификаций, хромосомных транслокаций, вирусных инсерций и мутаций в кодирующих или регуляторных районах, которые приводят к усилению экспрессии генов туе . В 0 случаев лимфомы Беркета наблюдается транслокация гена стус под энхансер генов иммуноглобулинов, что обеспечивает высокий и постоянный уровень экспрессии мРНК и белка сМус . Транслокации, затрагивающие ген стус также обнаружены в таких опухолях как диффузная клеточная лимфома, Тклеточная острая лимфоцитарная лейкемия и миелома . Амплификация гена стус или нарушение регуляции его экспрессии также обнаруживаются во многих типах опухолей, включая меланомы, карциномы груди, простаты и кишечника , , . Амплификация гена Ытус является ключевым моментом в развитии таких опухолей как нейробластомы , , ретинобластомы , медуллобластомы , и глиобластомы , в то время как Ыпус часто амплифицирован при опухоли яичников . Все три онкогена семейства туе могут быть амплифицированы в клетках карциномы легких . В последние годы становится понятным, что нарушение регуляции генов семейства туе не ограничивается крупными генетическими изменениями, такими как транслокации или амплификация, но также может бьггь результатом мутаций в регуляторных элементах, контролирующих экспрессию генов туе . Одной из наиболее частых причин усиления экспрессии генов туе являются мутации в промоторном районе, которые приводят к нарушению регуляции его экспрессии 1. Другим механизмом усиления экспрессии является стабилизация туе мРНК за счет добавления или потери последовательностей в 3 или 5нетранслируемом районе 1. Рис. МАРК, фосфатидилинозитол3киназы РК, генов сигнального пути мп1ТСР1. ЕР, а также сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции ЭТАТ. В норме экспрессия генов туе регулируется определенными внеклеточными сигналами например митогенами, белки Мус, в свою очередь, участвуют в регуляции многих биологических процессов в клетке рис. Нарушение регуляции Мус приводит не только к активации клеточной пролиферации, роста и злокачественной трансформации, но и к индукции апоптоза, геномной нестабильности, усилению ангиогенеза и блокировке дифференцировки . Контроль таких разнонаправленных процессов белками Мус осуществляется путем регуляции различных фупп геновмишеней. На сегодняшний день еще не до конца изучены связи между функцией Мус, как транскрипционного регулятора, и контролируемыми им биологическими процессами. Ниже будут рассмотрены взаимодействия Мус с другими белками необходимыми для проявления его функциональной активности, а также известные генымишени, регулируемые этим транскрипционным фактором. Белки Мус относят к суперсемейству транскрипционных факторов, содержащих участок основный участок, спиральпетляслираль, лейциновая молния . Мус содержит два домена концевой трансактивационный домен , и Сконцевой гетеродимеризационный домен рис. В состав Сконцевого домена входит участок необходимый для связывания Мус с его ближайшим партнером белком Мах, также содержащим домен. Димер МусМах способен специфически связываться с ДНК, содержащей коровую гексануклеотидную последовательность Ебокс . Кроме того, Сконец белка содержит сигнал ядерной локализации, необходимый для проникновения Мус в ядро, где он и выполняет свои функции как транскрипционный фактор. В концевом домене находятся несколько высококонсервативных последовательностей, называемых Мус боксы, которые совместно с Сконцевым доменом и являются отличительной особенностью белков семейства Мус рис. Несмотря на то, что последовательность Мус бокс I I необходима для генной активации, делеция этого района только частично нарушает трансформирующую способность Мус , . Последовательность Мус бокс II II необходима для трансформирующей активности Мус, запуска клеточной пролиферации и ингибирования дифференцировки . Недавно был обнаружен третий консервативный район Мус бокс III 8III, который участвует в процессах клеточной трансформации, лимфомагенеза и апоптоза . I
i
i1

II
I

i
Рис. Структура белка сМус . Участки взаимодействия с другими белками обозначены черными прямоугольниками. Мус , 1 2 а. Мус бокс I III I, II и III и кислотный район . Сконцевой домен Мус , 3 9 а.