Иммунохимический анализ цитокинин-связывающего белка из проростков кукурузы

• Автор: Шепеляковская, Анна Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 98 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Открытие мембранного рецептора цитокининов

1.1.1 Бикомпонентная регуляторная система.

1.1.2. Обнаружение и характеристика генов АгаЬ орз5, кодирующих

сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала.

1.1.3. Другие белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные

в передаче цитокининового сигнала

1.1.3.1. Характеристика белковрегуляторов ответа Атипа.

1.1.3.2. Характеристика белков регуляторов ответа Втипа.

1.1.3.3. Обнаружение и характеристика фосфотрансмитгсрных белков.
1.1.4. Обобщение данных о передаче цитокининового сигнала через
мембранный рецептор
1.2.Цитоплазматические и ядерные цитокининсвязывающие
1.3. Обнаружение и характеристика цитокининсвязывающих белков в
хлоропластах.
1.4. Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках
растений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Растительный материал.
2.2. Моноклональные антитела против ЦСБ.
2.3. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости мышей
2.4. Выделение моноклональных антител из культуральной среды.
2.5. Биотинилированис МА.
2.6. Фракционирование белкового экстракта из проростков кукурузы
2.7. Определение цитокининсвязывающей активности белков.
2.8. Сэндвичвариант твердофазного ИФА.
2.9. Получение белковых экстрактов из различных частей проростка.
Щ 2 Определение числа клеток
2 Определение содержания белка
2 Определение содержания эндогенных цитокининов.
2 Выделение полирибосом.
2 Синтез аффинного сорбента на основе МА и 4
i.
2 Синтез аффинного сорбента на основе зеатинрибозида и
.
2 Аффинная хроматография полисом на колонке с
иммобилизованными МА
2 Клонирование кДНК 1й вариант.
2 Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованным
зеатинрибозидом.
2 Клонирование кДНК 2й вариант.
2 Анализ библиотек кДНК методом иммуноскрининга на чашках.
2 Анализ клеточных белков i методом иммуноблотинга
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Моноклональные антитела к ЦСБ, их выделение и характеристика
3.2. Разработка тсстсистсмы для анализа ЦСБ на основе ссндвич
варианта ИФА в сочетании с стрептавидинбиотиновой системой
3.3. Локализация ЦСБ в меристеме и зоне растяжения корня.
3.4. Локализация ЦСБ в этиолированном проростке кукурузы.
3.5. Динамика содержания ЦСБ в различных органах проростка в
процессе его роста.
Ф 3.6. Использование моноклональных антител для выделения мРНК,
конструирования и анализа библиотеки кДНК из проростков кукурузы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


ВВЕДЕНИЕ. ГЛАВА 1. Бикомпонентная регуляторная система. Характеристика белковрегуляторов ответа Атипа. Характеристика белков регуляторов ответа Втипа. Обнаружение и характеристика фосфотрансмитгсрных белков. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Растительный материал. Моноклональные антитела против ЦСБ. Выделение моноклональных антител из культуральной среды. Биотинилированис МА. Определение цитокининсвязывающей активности белков. Сэндвичвариант твердофазного ИФА. Получение белковых экстрактов из различных частей проростка. Определение содержания эндогенных цитокининов. Выделение полирибосом. i. . Клонирование кДНК 1й вариант. Клонирование кДНК 2й вариант. Анализ библиотек кДНК методом иммуноскрининга на чашках. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Локализация ЦСБ в меристеме и зоне растяжения корня. Локализация ЦСБ в этиолированном проростке кукурузы. Ф 3. ДНК из проростков кукурузы. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. ЛИТЕРАТУРА. Т зеатинрибозид Тоуореаг ВВЕДЕНИЕ. , . Ы6замсщенными производивши аденнна. Кунаева, . Это обстоятельство осложняет изучение молекулярных механизмов действия индивидуальных фитогормонов. Тем не менее, за последние несколько лет в области изучения механизма действия цитокининов достигнут значительный прогресс. В растениях найдены гены, кодирующие ключевой фермент биосинтеза цитокининов изопентенилтрансферазу, открыт мембранный рецептор цитокинина, идентифицированы гены первичного ответа на цитокинин и выделены белковые факторы транскрипции, участвующие в регуляции экспрессии этих генов. Вместе с тем обнаружены факты, указывающие на наличие альтернативных путей восприятия и передачи цитокининового сигнала i i, v . В связи с этим привлекает интерес цитокининсвязывающий белок, выделенный из цитоплазмы и ядер листьев ячменя ЦСБ кД v . Для этого белка показана высокая избирательность и аффинность в связывании природного цитокинина трансзсатина v , , которое приводит к формированию функционально активного комплекса, способного активировать транскрипцию i vi v . Селиванкина и соавт. Эти данные позволяли рассматривать ЦСБ в качестве ядерного рецептора цитокинина, участвующего в комплексе с ним в регуляции транскрипции. В нашей лаборатории из этиолированных проростков кукурузы был выделен цитокининсвязывающий белок с мол. Д ЦСБ Бровкой соавт. Этот белок проявлял способность обратимо связывать цитокинин, взаимодействовал с антиидиотипическими антителами, которые были получены против антител к трансзсатину, а также усиливал цитокинининдуцирусмую транскрипционную активность i vi в системе, содержащей хроматин и РНКполимсразу из листьев ячменя. Эти свойства указывали на возможное родство ЦСБ из проростков кукурузы с выделенным ранее ЦСБ из листьев ячменя v . К ЦСБ была получена представительная панель моноклональных антител. При использовании этих антител сделанное ранее предположение о функциональном и структурном подобии ЦСБ из проростков кукурузы и ЦСБ из листьев ячменя было подтверждено экспериментально. На наш взгляд, выделенный ЦСБ весьма интересен для дальнейших исследований на предмет изучения его роли в цитокининрегулирусмых процессах в растительном организме. Цель данной работы состояла в разработке и применении высокочувствительных и высокоспецифичных методов анализа цитокиниксвязывающего белка кД, основанных на применении моноклональных антител.