Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана

• Автор: Черкасова, Елена Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитин природный биополимер.

1.1.2. Пространственная организация хитина

1.1.3. Комплексы хитина с полисахаридами,

пигментами, белками.

1.2. Пути метаболизма хитина

1.2.1. Ферменты биосинтеза хитина.

1.2.2. Ферменты деградации хитина

1.2.2.1. Хитиназы распространение, классификация

1.2.2.2. Хитиндеацетилазы многофункциональность действия.

1.3. Хигозан получение, основные характеристики
1.4. Получение олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана
1.4.1. Зависимость биологической активности
хигозанов от молекулярной массы.
1.4.2. Биологические способы получения
олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана
1.4.3.Ферменты деградации хитозана хитозаназы
1.4.3.1. Классификация.
1.4.3.2. Механизм катализа.
1.4.4. Ферменты других классов, способные к гидролизу
хитозана
1.4.5. Папаин представитель обширной группы амидгидролаз
1.4.5.1. Место папаина в современной классификации.
1.4.5.2. Специфичность и эффективность.
1.4.5.3. Эсгеразная активность.
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований.
2.2. Материалы исследований.
2.3. Методы анализов
2.3.1. Определение молекулярномассовых характеристик исходного хитозана и продуктов его гидролиза
2.3.2. Определение электронейтральных точек хитозанов.
2.3.3. ИКфурьеспектроскогшческий анализ хитозана и продуктов его гидролиза папаином
2.3.4. Измерение величины поверхностного
натяжения солей хитозанов и его олигомеров
2.3.5. Определение бактсрицидности солей
низкомолекулярного хитозана.
2.3.6. Определение аминогрупп хитозана и количества
кислоты методом потенциометрического титрования.
2.3.7. Колориметрическое определение концентрации
продуктов гидролиза хитозана в растворе.
2.3.8. Определение белка
2.3.9. Вискозиметрические методы определения хитозанолитической активности папаина
2.3.9.1. Определение оптимальной температуры
гидролиза хитозана папаином
2.3.9.2. Определение оптимальной
гидролиза хитозана папаином
2.3.9.3. Определение остаточной активности
папаина при различных температурах.
2.3.9.4. Определение основных кинетических
параметров реакции.
2.3 Статистическая обработка данных.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Окислительная деструкция хитозана пероксидом водорода
3.2. Установление оптимальных условий гидролиза
хитозана папаином
3.2.1. Выбор концентрации ферментного препарата папаина.
3.2.2. Выбор оптимальной температуры проведения реакции гидролиза
3.2.3. Выбор оптимального значения проведения реакции гидролиза
3.3. Особенности гидролиза хитозана папаином
3.3.1. Влияние молекулярной массы и степени деацетили
рования хитозана на скорость реакции гидролиза
3.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость
реакции гидролиза.
3.3.3. Гидролиз хитозана ферментными препаратами различного происхождения
3.4. Молекулярномассовые характеристики олигомеров и низкомолекулярного хитозана
3.4.1. Влияние молекулярной массы хитозана на характеристики продуктов гидролиза.
3.4.2. Эффективное использование ферментного препарата
папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана.
3.4.3 Вискозиметрическое определение молекулярной
массы олигомеров хитозана.
3.5. Получение солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана
3.5.1. Получение низкомолекулярного хитозана в среде различных органических кислот
3.5.2. Получение опытной партии солей
низкомолекулярного хитозана.
3.6. Области применения олигомеров и низкомолекулярного хитозана
3.6.1. Бактерицидные свойства солевых форм низкомолекулярного хитозана
3.6.2. Поверхностноактивные свойства солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВПЖ вискозиметр прозрачных жидкостей ГПХ гель проникающая хроматография ДДСЫа додецилсульфат натрия ММ молекулярная масса ММР молекулярномассовое распределение ПААГ полиакриламидный гель ПАВ поверхностноактивные вещества СД степень деапегилирования
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Расширение областей использования хитозанов с различной ММ делает актуальным использование коммерческих препаратов с неспецифической активностью целлюлаз, липаз, амидгидролаз для деполимеризации природного высокомолекулярного хитозана Vii . Эффективность действия амидгидролазы растительного происхождения папаина К. Ф. 3. ММ и СД на скорость гидролиза. Актуальность темы диссертации связана с выявлением особенностей гидролиза хитозана с использованием папаина, определением кинетических характеристик процесса, а также с разработкой научной основы для технологичного ферментативного способа получения олигомеров и хитозанов с низкими регулируемыми значениями ММ. Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение хитозанолитической активности папаина в различных условиях для разработки эффективных методов получения олигомеров и хитозана с низкими регулируемыми значениями ММ. ММ. Методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДСКа доказана высокая чистота используемого препарата папаина и подтверждено, что гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаии, а не хитозаназы примесей. Впервые методом ИКфурьесггектроскоиии доказана полная идентичность структуры исходного хитозана и продуктов, получаемых в результате гидролиза хитозана папаином в среде различных органических кислот. Гидролиз хитозана пероксидом водорода в окислительновосстановительной системе с участием аскорбиновой кислоты является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку также не приводит к изменению структуры основной цепи хитозана. Впервые установлено влияние СД и ММ исходного хитозана на скорость ферментативного гидролиза хитозана папаином и свойства получаемых продуктов с увеличением СД возрастает значение УП1ах, в то время как ММ субстрата практически не оказывает влияния на данный кинетический параметр и на кга. Вместе с тем, величина ММ существенно сказывается на ММР продуктов ферментативного гидролиза. Наибольшее значение Утах наблюдается при реакции 4,8 5,5, когда аминогруппы хитозана переходят в непротонированное состояние, а макромолекула не несет никакого заряда. Величина поверхностного натяжения растворов солей олигомеров хитозана зависит как от природы аниона остатка органической кислоты, так и от ММ олигомеров. Изученные соли низкомолекуляриого хитозана обладают бактерицидной активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. В работе предложен и реализован ферментативный метод получения олигомеров и хитозана с ММ 2,,2х4 с использованием папаина в водных растворах различных органических кислот и умеренной концентрацией субстрата до мае. Метод основан на дробном введении ферментного препарата в высоковязкостную среду реакции. Практическая значимость работы заключается в разработке научных основ технологии промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ 2,,2х . Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 8й Международной конференции по химии и физикохимии олигомеров Олигомеры Черноголовка, , на 7й Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана СанктПетербург, , на й Нижегородских сессиях молодых ученых Нижний Новгород, ,, на 8й Международной школеконференции молодых ученых Пущино, , на конференции молодых ученых Современные проблемы науки о полимерах СанктПетербург, , на третьем съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова Москва, , на заседании Нижегородского отделения биохимического общества Нижний Новгород, . Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать работ. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 4 страницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунка. Список цитируемой литературы включает 1 наименование.