Изучение процесса аморфной агрегации белка оболочки вируса табачной мозаики : действие детергентов

• Автор: Панюков, Юлий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 175 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агрегация белков

1.1. Классификация агрегации белков по структуре агрегатов

1.2. Упорядоченная агрегация белков

1.3. Неупорядоченная аморфная агрегация белков

1.4. Связь агрегации белков с заболеваниями человека и животных

1.4.1. Амилоидные заболевания

1.4.2. Прионные инфекции

1.4.3. Прочие заболевания
1.5. Влияние детергентов на агрегацию белков
1.5.1. Понятие детергентов
1.5.2. Индукция и ингибирование детергентами аморфной агрегации белков
1.5.3. Индукция и ингибирование детергентами амилоидной агрегации белков
1.5.4. Детергенты как искусственные шапероны
2. БО ВТМ как модель для изучения агрегации белков
2.1. Структура вириона ВТМ
2.2. Упорядоченная агрегация БО ВТМ полимеризация
2.2.1. Разнообразие упорядоченных агрегатов БО ВТМ
2.2.2. Структура БО ВТМ в составе вирионов ВТМ
2.2.3. Структура БО ВТМ в составе Бдисков
2.3. Неупорядоченная аморфная термоиндуцированная агрегация БО ВТМ
2.3.1. Зависимость термоиндуцированной агрегации БО ВТМ от условий среды
2.3.2. Температура термической денатурации БО ВТМ
2.3.3. Частично развернутая форма БО ВТМ
2.3.4. Механизм термической денатурации БО ВТМ
2.3.5. Кинетический анализ прироста мутности при термоиидуцированной агрегации БО ВТМ
2.3.6. Взаимодействия белковых молекул в ходе термоиндуцированной агрегации БО ВТМ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
2. Накопление и выделение вирионов ВТМ
3. Выделение белка оболочки ВТМ
4. УФспектроскония
5. Определение истинного поглощения светорассеивающих систем методом экстраполяции
6. Турбидиметрия
7. Флуоресцентная спектроскопия
8. Спектроскопия кругового дихроизма
9. Аналитическое ультрацентрифугирование
. Динамическое лазерное светорассеяние
. Дифференциальная сканирующая калориметрия
. Определение ККМ детергентов методом УФспектроскопии методика i и соавт.
. Определение стехиометрии связывания ЦТАБ и БО ВТМ
. Математические расчты
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Влияния детергентов разных групп на термоиндуцированную С аморфную агрегацию ЬО ВТМ
1.1. Анионный детергент ДСП
1.1.1. Ингибирование термоиндуцированной агрегации БО ВТМ
1.1.2. Реверсия термоиндуцированной агрегации БО ВТМ при помощи ДСН
1.2. Катионный детергент ЦТАБ
1.2.1. Низкие концентрации ЦТАБ значительно ускоряют ход термоиидуцированной агрегации БО ВТМ
1.2.2. ЦТАБ в высоких концентрациях проявляет свойства искусственного шаперопа в отношении БО ВТМ
1.3. Неполный детергент Тритон Х0 в зависимости от концентрации по разному влияет на термоиндуцированную агрегацию БО ВТМ
2. Влияния трех разных детергентов на БО ВТМ при комнатной температуре
2.1. Индукция аморфной агрегации ВТМ и его БО при С катионным детергентом ЦТАБ
2.1.1. Зависимость кинетики прироста мутности от соотношения компонентов в ходе агрегации БО ВТМ, индуцируемой ЦТАБ
2.1.2. Влияние ионной силы среды на кинетику индуцированной ЦТАБ агрегации БО ВТМ
2.1.3. Структура молекул БО ВТМ в составе ЦТАБиидуцированных агрегатов
2.1.4. Стехиометрия детергентбелковых комплексов
2.1.5. Определение ККМ ЦТАБ по методике, предложенной i и соавт.
2.1.6. Реверсия ЦТАБиндуцированной агрегации БО ВТМ при помощи 2 ДСП
2.1.7. Структура молекул БО ВТМ, освобожднных из ЦТАБ 5 индуцированных агрегатов
2.1.8. Сравнение кинетики ЦТАБиндуцированной при С и 7 термоиндуцированной при С агрегации БО ВТМ методом ДЛС
2.1.8.1. Изучен не методом ДЛС термоиидуцированной агрегации БО 7 ВТМ
2.1.8.2. Изучение методом ДЛС ЦТАБиндуцированной агрегации БО 7 ВТМ
2.1.9. Сравнение кинетики ЦТАБиндуцированной агрегации БО ВТМ 9 разными методами
2.1 Сверхнизкие концентрации ЦТАБ препятствуют агрегации БО 0 ВТМ в процессе хранения на комнатной температуре
2.1 Агрегация цельных вирионов ВТМ, индуцируемая ЦТАБ при С
2.2. Влияние анионного детергента ДСН на БО ВТМ при комнатной температуре
2.3. Индукция аморфной агрегации БО ВТМ неионным детергентом Тритон X 5
2.3.1. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 5 от температуры
2.3.2. Зависимости кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 8 при С от соотношения компонентов
2.3.3. Определение ККМ Тритон Х0 по методике, предложенной i и 8 соавт.
2.3.4. Зависимость кинетики прироста мутности в ходе агрегации БО ВТМ 0 при С от ионной силы среды
2.3.5. Изучение влияния Тритон Х0 на БО ВТМ методом ДСК
2.3.6. Изучение методом ДЛС аморфной агрегации БО ВТМ, 2 индуцированной Тритон Х0 при С
2.3.7. Реверсия ДСН аморфной агрегации БО ВТМ, индуцированной Тритон 3 Х0 при С
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Влияние детергентов разных групп на термоиндуцированную С 6 аморфную агрегацию БО ВТМ
2. Влияние детергентов разных групп на БО ВТМ при комнатной температуре
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Многие амилоидные агрегаты указанных выше белков были впервые получены в лаборатории i М. Тот факт, что амилоидные фибриллы могут быть сформированы непатогенными белками и пептидами, позволили выдвинуть гипотезу, согласно которой фолдинг белков и агрегация, ведущая к образованию амилоидных фибрилл, являются двумя альтернативными способами организации полипептидной цепи в упорядоченную структуру, присущими большинству а, может быть, и всем полипептидам ii . Параллельно с обнаружением возможности получения амилоидных агрегатов из непатогенных белков накапливались данные, свидетельствующие об отсутствии цитотоксичности у зрелых амилоидных фибрилл и наличии таковой у промежуточных продуктов их формирования. Действительно, не всегда наблюдается прямая связь между количеством амилоидных агрегатов и тяжестью заболевания . Детальная структура таких агрегатов до конца не выяснена. Заметим, что в исследовании были использованы фрагменты белков, не вызывающих какихлибо заболеваний. Авторы получили амилоидные агрегаты из концевого домена белка из . Некоторые белки и пептиды, связанные с заболеваниями человека и животных асинуклеин, пептид могут формировать не только амилоидные фибриллы, но и сферические агрегаты, которые также являются цитотоксичными i . Возможно, мотив является общим структурным элементом при образовании упорядоченных надмолекулярных агрегатов с разной пространственной структурой. Более подробно о белках, вызывающих заболевания см. Связь агрегации белков с заболеваниями человека и животных. В отличие от упорядоченных агрегатов, аморфные агрегаты белков и пептидов имеют неупорядоченную структуру, т. I vi их аморфная агрегация часто происходит при действии химических денатурантов мочевины, гуанидин хлорида, высокой температуры, давления или при хранении , i . В противоположность процессу упорядоченной агрегации, к аморфной агрегации при тех или иных условиях склонно большинство если не все известных белков, включая и те белки, для которых в норме характерно образование упорядоченных надмолекулярных структур . На протяжении многих лет аморфная агрегация белков была интересна прежде всего с точки зрения биотехнологии, поэтому объектами изучения являлись те белки, которые являются основными компонентами пищевых продуктов v i, . Такой подъм обусловлен, повидимому, увеличением доли белков и пептидов среди лекарственных препаратов. Чтобы сохранять биологическую активность белки и пептиды должны находиться в своей специфической пространственной конформации. Однако нативная конформация стабильна лишь до некоторой степени и поэтому небольшие влияния извне могут нарушать структуру белка или пептида, переводя его в ненативное состояние, вызывать потерю биологической активности и, достаточно часто, аморфную агрегацию белковых молекул. Подобные эффекты часто имеют место в ходе получения, хранения и транспорта лекарственных препаратов, содержащих белки и пептиды , . Например, ряд производственных процедур, таких как фильтрация Маа , , взбалтывание Маа , i, , замораживание и оттаивание , I , vi, , лиофилизация , или распылительная сушка , i , i i, могут приводить к нарушению нативной структуры белка и, как следствие, к аморфной агрегации. Кроме того, аморфная агрегация белков может нарушать биологическую активность белковых препаратов и вызывать иммунную реакцию у пациентов , . Структурные исследования процесса аморфной агрегации сильно затрудняются нестабильностью и гетерогенностью изучаемых систем, а исследования самих агрегатов их большими размерами и отсутствием упорядоченного характера структуры. Необходимость жстких условий среды, химических денатурантов или длительной инкубации также создает трудности в изучении процесса. Поскольку аморфные агрегаты белков обычно имеют большой размер, они обладают повышенной способностью рассеивать падающий свет по сравнению с отдельными белковыми молекулами. Поэтому метод тубидиметрии измерения мутности кажущегося поглощения при длине волны свыше 5 им. Изучение кинетики аморфной агрегации белков в ряде работ проводится именно этими методами Орлов и др. Курганов и др.