Изучение Д-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы при помощи катионного флуоресцентного зонда - аурамина О

• Автор: Кличко, Владимир Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 179 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура и свойства ДглицеральдегидЗфосфатдегидрогеназы

1.1. Строение молекулы ГАФД

1.2. Структура активного центра ГАФД.

1.3. Кооперативные свойства ГАФД.

1.4. Полуцентровые свойства ГАФД.

1.5. Модели, объясняющие строение ГАФД.

1.6. Значение димердимерной организации ГАФД в процессе катализа

2. Применение конформационных зондов

2.1. Значение конформационных проб для исследования ферментов
2.2. Применение флуоресцентных зондов для исследования ферментов
2.3. Природа флуоресцентных зондов.
2.4. Участки белков, связывающие зонды.
2.5. Поляриметрические методы в исследованиях, связанных с применением конформационных зондов
2.6. Флуоресцентные свойства аурамина 0 .
2.7. Аурамин 0 как конформационный зонд
2.8. Применение аурамина 0 для исследования алкогольдегидрогеназы АДГ из печени.
2.9. Применение аурамина 0 для исследования алкогольдегидрогеназы АДГ из дрожжей
2Взаимодействие алкогольдегидрогеназы с другим катионными зондами .
стр.
2 Применение производных этеноцитозина для исследования ГАфЦ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .
1. Использованные реактивы
2. Определение концентраций и приготовление растворов реактивов
3. Выделение ГАфЦ из пекарских дрожжей .
4. Выделение ГАЩЦ из скелетных мышц кролика .
5. Получение алофермента ГАфЦ из мышц кролика .
6. Определение концентрации белка в препаратах ГАФД . .
7. Определение энзиматической активности ГАФД .
8. Избирательная модификация 5Нгрулп активных центров фермента иодацетатом и иодацетамидом
9. Флуориметрические исследования .
. Титрование белка красителем
. Титрование комплекса ГАФДаурамин 0 лигандами
. Спектрофотометрические измерения .
. Поляриметрические исследования .
. Исследования методом равновесного диализа
. Седиментационный анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Флуоресценция аурамина 0, связанного с ГАФД
2. Влияние среды на флуоресценцию связанного аурамина 0
3. Влияние ионов на связывание аурамина 0 с ГАФД
4. Флуоримиетрическое титрование препаратов фермента
аурамином 0
5. Исследование связывания флуоресцентного зонда
дегидрогеназой методом равновесного диализа .
стр.
6. Связывание акридинового оранжевого с ГАФД из пекарских дрожжей . . 9П
7. Влияние НАД на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАФД
8. Влияние НАДН на флуоресценцию и связывание аурамина 0 с ГАФД. .
9. Исследование связывания аурамина 0 с ГАфЦ методом кругового дихроизма
. Взаимодействие с ГАфЦ никотинамидмононуклеотида . . III
. Влияние аденинсодержащих фрагментов НАД на связывание аурамина 0 с ГАФД и на флуоресцентные характеристики зонда.
. Влияние субстрата и его аналогов на связывание аурамина 0 с ГАфЦ и флуоресцентные характеристики
зовда .
. Изучение модифицированного фермента
З. I. Модификация фермента ДТНБ
.2. Модификация фермента алкилирующими агентами .
. Влияние аурамина 0 на реакцию, катализируемую ГАфЦ
. Изучение способности аурамина 0 связываться с субъединицами ГАфЦ в различных функциональных состояниях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Сравнение пространственной структуры коэнзимсвязывающих доменов дегидрогеназ показало ее значительное сходство у разных ферментов несколько неожиданным оказалось, однако, что эти домены формируются отрезками полипептидных цепей, сильно различных по аминокислотной последовательности. При сравнении аминокислотной последовательности мономера ГАЩЦ из омара с последовательностями того же фермента из дрожжей и мышц свиньи оказалось, что коэнзимсвязывающий домен имеет меньше консервативных остатков, чем каталитический. Наиболее консервативными оказались остатки, вовлеченные в межсубъединичные контакты и строение активного центра фермента , 1. Высокая консервативность аминокислотных остатков в межсубъединичных контактах указывает на их важную роль в функционировании дегидрогеназы. Структура активного центра ГАЩЦ. На рис. ГАЩЦ. Центральное место в активном центре занимает остаток цис9, расположенный между двумя доменами. БНгруппа этого цистеина образует с субстратом, ДглицеральдегидЗфосфатом 3ФГА, тиоэфирную связь 6. Цис9 высоко консервативен во всех исследованных последовательностях ГАЩЦ , , , 8, 9, 4, 6. Рис. Схематическое изображение активного центра ГАЩЦ со связанными в нм НАД и двумя ионами фосфата. Этот остаток осуществляет основной катализ на этапе дегидрирования субстрата и также является консервативным во всех исследованных последовательностях ГАЗД , , , 8, 9, 6, 4. В активном центре обнаружено два анионсвязывающих участка один из них связывает неорганический фосфат, а второй фосфат молекулы субстрата 9, 2, . ВДГ и АДГ влечет за собой сходство в конформации НАД, находящегося в комплексе с этими ферментами , 5, , , . Как показано на рис. Важная особенность конформации. НАД, связанного с ГАЗД, заключается в повороте на 0 никотинамидного цикла относительно гликозидной связи, что приводит к конформации и обусловливает Б специфичность ГАЗД, в отличие от ДЦГ, АДГ и МДГ, которые являются А специфичными , 2. Никотинамидный цикл коферента расположен в непосредственной близости от цис9. При переходе ГАЗД в холоконформацига возникает широкая полоса поглощения с максимумом в районе 0 нм, ее принято называть полосой Рэкера, в честь автора, открывшего это явление 1. Результаты рентгеноструктурного анализа показали, что возникновение этой полосы обусловлено образованием комплекса с переносом заряда между никотинамвдным циклом и 5Нгруппой цис9 . Ацениновый цикл НАД расположен в гидрофобной области активного центра и ориентирован в ап конформации относительно рибозы, связанной с ним гликозидной связью 2. Эта область фермента может связывать и другие гидрофобные молекулы. Тот факт, что большое разнообразие алифатических и гетероциклических со единений являются ингибиторами пиридиннуклеотццзависимых дегидро
геназ, обусловлен свойствами именно этого участка . Кооперативные свойства ГА2Щ. ГАШД, изолированная из различных источников, является тетрамером и состоит из субъединиц идентичных по аминокислотной последовательности . Однако, субъединичные взаимодействия приводят к возникновению конформационной неэквивалентности между субъединицами в тетрамере, которая проявляется в кооперативном связывании кофермента. Связывание НАД с ГАЗД из мышц кролика , омара 4, осетра 9,i i характеризуется отрицательной кооперативностью, т. ГАЩЦ организована как димер димеров. Эго означает, что взаимодействие по одному типу контактов является преобладающим, и возникновение кооперативных эффектов проявляется на уровне дилера. Димердимерная организация хорошо выражена в ГАфД из мышц кролика для фермента из этого источника характерно наличие двух типов участков связывания кофермента. Первые два эквивалента НАД связываются в участках с высоким сродством с константами диссоциации Кц, равными 1Г8 КГ М и х I Ю9 М для первой и второй субъединицы, соответственно , 3. Третья и четвертая молекулы НАД связываются ферментом менее прочно, с Кд,равными 0,,0 х I М и 2,,6 х 1СГ8 М, соответственно , 0, 3. Связывание НАД с ГАШД из пекарских дрожжей имеет более сложный характер, сочетающий черты как положительной, так и отрицательной кооперативное. Константы ассоциации Ка для четырех активных центров, при последовательном заполнении, оказались равными 4,5 х ТО3 М 1,4 х ТО5 М 7,5 х ТО4 М и 3,6 х Ю3 М, соответственно .