Изучение взаимодействия липопротеидов с компонентами матрикса аорты человека и его роли в клеточных проявлениях атеросклероза

• Автор: Супрун, Игорь Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 177 с. : ил.

1.1. Эластин непораженной и атеросклеротической аорты

1.1.1. Содержание и состав эластина

1.1.2. Взаимодействие эластина с липопротеидами

1.2. Протеогликаны непораженной и атеросклеротической аорты.

1.2.1. Содержание и состав протеогликанов

1.2.2. Взаимодействие протеогликанов с липидами

и липопротеидами.

1. 3. Коллаген непораженной и атеросклеротической аорты

1.3.1 Содержание и состав коллагена.

1.2. Взаимодействие коллагена с липопротеидами

Глава 2. Модифицированные липопротеиды низкой плотности

плазмы крови человека.
Глава 3. Иммунные механизмы в атеросклерозе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4 Материалы и методы.
4.1. Выделение эластина из аорты человека
4.2. Выделение протеогликанов из аорты человека
4.3. Выделение коллагена из аорты человека.
4.4. Выделение липоиротеидов из плазмы крови человека
4.5. Получение нативных и циркулирующих
модифицированных липоиротеидов из плазмы крови человека
4.6. Приготовление иодмеченых препаратов липопротеидов
4.7. Приготовление комплексов ЛНП с эластином, протеогликанами и коллагеном.
4.8. Получение коллагеназарезистентного дебриса.
4.9. Определение содержания белка
4 Измерение содержания сиаловой кислоты
4 Измерение уроновой кислоты.
4 Измерение содержания гидроксииролина.
4 Определение состава протеогликанов.
4 Измерение взаимодействия липопротеидов с внеклеточным матриксом.
. Измерение связывания ЛНП, ЛОНП, ЛПП с матриксом
. Измерение связывания ЛВП с матриксом.
. Измерение связывания липопротеидов с матриксом радиоизотопным методом
. Измерение обратимости связывания ЛНП с внеклеточным матриксом
4 Выделение и культивирование гладкомышечных
клеток интимы аорты человека.
4 Выделение белых клеток крови человека
4 Культура макрофагов человека.
4 Культивирование клеток с исследуемыми липопротеидами низкой плотности и их комплексами.
4 Определение содержания внутриклеточного
холестерина
4 Измерение клеточного белка
4 Измерение экспрессии молекулы
гистосовместимости II типа.
4 Измерение экспрессии интерлейкина1 и фактора некроза опухолиа.
4 Статистическая обработка данных
Глава 5. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с компонентами соединительнотканного матрикса из интимы и медии
непораженной и атеросклеротической аорты человека
5.1 Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с эластином, выделенным из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.
5.1.1. Эластин непораженной и атеросклеротической
аорты человека.
5.1.2. Связывание нативных и циркулирующих
модифицированных ЛНП с эластином.
5.1.2.1. Прочность комплексов ЛИП с эластином
5.1.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с эластином
5.1.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛИП с эластином.
5.1.5. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с эластином.
5.1.6. Взаимосвязь между аминокислотным составом
эластина и связыванием липопротеидов.
5.1.7. Влияние десиалирования на связывание липопротеидов с эластином
5.1.8. Обсуждение результатов
5.2. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с протеогликанами
из интимы и медии непораженной и
атеросклеротической аорты человека
5.2.1. Протеогликаны непораженной и атеросклеротической аорты человека
5.2.2. Связывание нативных и циркулирующих
модифицированных ЛШ1 с протеогликанами аорты человека
5.2.2.1. Прочность комплексов ЛНП с протеогликанами
5.2.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП с протеогликанами
5.2.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с протеогликанами
5.2.5. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с протеогликанами.
5.2.6. Взаимосвязь между составом глюкозаминогликанов протеогликанов и связыванием липопротеидов.
5.2.7. Влияние десиалирования на связывание липопротеидов
с протеогликанами
5.2.8. Обсуждение результатов
5.3. Взаимодействие нативных и циркулирующих модифицированных липопротеидов с коллагеном,
выделенным из интимы и медии непораженной и атеросклеротической аорты человека.
5.3.1. Связывание нативных и циркулирующих
модифицированных ЛНП с коллагеном
5.3.2. Связывание нативных и циркулирующих
модифицированных ЛОНП с коллагеном.
5.3.3. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛПП с коллагеном
5.3.4. Связывание нативных и циркулирующих модифицированных ЛВП с коллагеном
5.3.5. Влияние удаления сиаловой кислоты на связывание липоиротеидов с коллагеном.
5.3.6. Обсуждение результатов
Глава 6. Влияние комплексов липопротеидов и компонентов соединительнотканного матрикса на аккумуляцию липидов
в клетках интимы аорты человека.
6.1. Обсуждение результатов
Глава 7. Влияние внутриклеточного накопления липидов на экспрессию провоспалительных цитокинов макрофагами и гладкомышечными клетками интимы аорты человека
7.1. Обсуждение результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
апоВ апобслок В
БСА бычий сывороточный альбумин
ЬСАИФБ бычий сывороточный альбумин на изотоническом фосфатном буфере
ВЖХ высокоэффективная жид косная хроматография
ГАГ гшокозаминогликаны
ДС дерматансульфат
ИЛ1 интерлейкин
ИФБ изотонический фосфатный буфер
ЛВП липопротеиды высокой плотности
ЛИП липопротеиды низкой плотности
ЛОНП липопротеиды очень низкой плотности
ЛПП липопротеиды промежуточной плотности
МГСН молекула гистосовместимости II типа
Ф1 Юа фактор некроза опухоли а
ХСА хондроитинсульфат А
ХСС хондроитинсульфат А
ВС А0 ii i агглютинин
Введение


Аничков с сотрудниками описали первичное отложение жира вдоль эластиновых волокон аорты кроликов, получающих холестериновую диету, и человека Аничков . Ассоциацию сосудистых липидов с эластином позднее описали также i . Поэтому в последнее время активно изучается взаимодействие липопротеидов с компонентами внеклеточного матрикса. ЛОНП, промежуточной ЛПП, низкой ЛНП и высокой ЛВП плотности, изолированные из плазмы крови. ЛНП в аорте кроликов, содержащихся на холестериновой диете, и атеросклеротической аорте человека i . Vi выделили фракцию протеогликанов из аорты быка и человека, характеризующуюся высоким сродством к ЛПП, комплексы липопротеидов с этими протеогликанами, стимулируют накопление эфиров холестерина в макрофагах человека. Vi . В в артериях человека колокализован с фибриллами коллагена . Кроме того, в предшествующих работах использовали суммарные препараты липопротеидов, полученные из плазмы крови здоровых лиц. Таким образом, механизмы приводящие к внеклеточному отложению липидов,остаются не выясненными. Недавно мы обнаружили в крови человека циркулирующие модифицированные ЛНП десиалированные ЛНП v . Циркулирующие модифицированные липопротеиды, в отличие от нативных, вызывали аккумуляцию липидов в частности эфиров холестерина в клетках интимы аорты человека и макрофагах, т. Одной из основных характеристик циркулирующих модифицированных ЛНП цмЛНП является низкое содержание сиаловой кислоты терминального углевода биангенных цепей апоВ и углеводных цепей ганглиозидов v . Это свойство циркулирующих модифицированных липопротеидов позволяет выделить их из суммарной фракции с помощью лектинхроматографии на ii i ii v . ЦмЛНП характеризуются низким содержанием нейтральных сахаров и пониженным уровнем нейтральных липидов и фосфолипидов. Недавно нами было описано наличие в плазме крови человека нативных и циркулирующих модифицированных ЛОНП, ЛПП и ЛВП, которые как и подфракции ЛНП имеют различные свойства v v . Однако, до настоящего времени не было исследовано взаимодействие циркулирующих модифицированных липопротеидов с соединительнотканным матриксом. В настоящее время исследователи, работающие над изучением механизмов формирования и прогрессирования атеросклеротических поражений у человека, все большее внимание уделяют воспалительному компоненту атеросклеротических поражений. Показано, что количество гематогенных клеток, компонентов комплимента, экспрессия провоспалительных цитокинов значительно увеличивается в атеросклеротических поражениях по сравнению с непораженными участками артерий i , , . Подробно охарактеризованы клеточные популяции гематогенных клеток и описаны различные медиаторы воспаления, экспрессируемые этими клетками в очагах атеросклеротических поражений v . Рес1с1 . Однако, вопрос о том, может ли увеличение количества липидов в сосудистой стенке быть инициирующим моментом для развития воспалительной реакции при атеросклерозе, окончательно не решен. Целью данной работы явилось исследование механизмов внеклеточного отложения липидов, его роли во внутриклеточном накоплении липидов, и связи между клеточным липоидозом и инициацией воспалительной реакции в сосудистой стенке. Выявление влияния внутриклеточного накопления липидов на синтез провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках интимы аорты человека и макрофагах. Глава 1. Сосудистый внеклеточный матрикс и его взаимодействия с липидами и липопротеидами. Эластин непораженной и атеросклеротической аорты. Содержание и состав эластина. Эластин является одним из основных компонентов соединительнотканного матрикса. Эластин представляет собой комплекс микрофибрилл с аморфным матриксом. В артериях наибольшее количество эластина наблюдается во внутренней эластической мембране и в основном представлен фибриллами. Содержание эластина в интиме варьирует в зависимости от сосуда и степени интимального утолщения. При обычном методе выделения кипячением в 0,1 получают аморфный компонент эластина. Микрофибриллярный компонент при такой обработке растворяется, он также чувствителен к протеолитическим ферментам и растворяется в 5 М гуанидинхлориде или при разрыве дисульфидных связей i , .