Изучение антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L.

• Автор: Краснодембская, Анна Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 166 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Краткая история вопроса

1.2 Структурное разнообразие АМН.

1.3 Молекулярная биология антибиотических пептидов.

1.4 Механизмы антимикробного действия антибиотических пептидов.

1.5. К вопросу о разнообразии антимикробных пептидов.

1.6 Функциональные свойства АМП, отличные от антимикробной активности

1.7 Прикладные исследования

1.8 О состоянии современных знаний об АМП у разных групп животных

1.9 Заключение.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Получение биологического материала.
2.2 Цитохимические методы
2.3 Экстрагирование катионных пептидов.
2.4 Методы электрофореза.
2.5 Методы окраски пептидов в полиакриламидных гелях.
2.6 Обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.
2.7 Методы определения концентраций пептидов.
2.8 Методы определения дисульфидных связей в молекулах пептидов
2.9 Методы определения молекулярной массы пептидов.
2. Процедура переноса пептидов на V мембрану
щ 2. Определение аминокислотной последовательности пептидов
2. Методы определения антимикробной активности пептидов
2. Определение воздействия пептида на проницаемость внутренней мембраны .i.
2. Метод определения гемолитической активности пептидов
2. Метод оценки хемотаксической активности целомоцитов пескожила
2. Статистическая обработка результатов
2. Использованные для сравнительных исследований препараты антимикробных пептидов были получены из следующих источников
2. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1 Анализ препаратов
3.2 Выделение и очиспса антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила
3.2.1 Выделение и очистка ареницинов.
3.2.2 Определение аминокислотной последовательности ареницинов.
3.2.3 Выделение и очистка других катионных антимикробных пептидов
3.4 Изучение функциональных свойств ареницина1
3.4.1 Исследование антимикробной активности i vi.
3.4.1.1 Изучение влияния различных условий среды на проявляемую ареницином антимикробную активность.
4. 3. 2 Изучение влияния ареницина1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грамотрицательной бактерии ii i .
4.3.3 Изучение гемолитической активности ареницинов
4.3.4 Взаимодействие ареницина1 с лизоцимом человека
4.3.5 Изучение способности арницина1 вызывать направленную миграцию целомоцитов пескожила
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Анализ препаратов целомоцитов.
4.2 Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов.
4.3 Выделение, очистка и характеристика других антимикробных пептидов из
целомоцитов пескожила.
4 4 Функциональные свойства ареницина1.
4.4.1 Антимикробная активность i vi.
4. 4. 2 Влияние ареницина1 на изменение проницаемости цитоплазматической
мембраны 1рамотриштелыюй бактерии ii i
4 4.3 Гемолитическая активность ареницина1.
4.4.4 Взаимодействие ареницина1 с лизоцимом
4.4.5 Хемотаксическая активность ареницина1 в отношении целомоцитов пескожила
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


Прежде чем перейти к обзору данных, касающихся различных функциональных свойств АМП, имеет смысл кратко рассмотреть структурные особенности этих молекул. Структурное разнообразие АМП. Построить естественную классификацию антимикробных пептидов, основанную на общности происхождения структур, пока не удастся, т. Слишком мал список изученных в этом отношении видов живых организмов, чтобы делать обобщения касающиеся больших систематических групп. Требуется сравнение спектров антимикробных пептидов из разных видов, принадлежащих к разным таксонам, а также изучение специфичности их действия в отношении спектра микробов, контактирующих с данным видом организмов в естественных условиях. В г. Боман предложил классификацию, основанную на известной или предсказуемой третичной струкгуре Вотап, . Большое значение в этой системе придавалось наличию, количеству и аранжировке дисульфидных связей в молекуле пептида. В соответствии с ней выделялось пять структурных классов. К настоящему моменту опять говорят о пяти группах АМП , . Надо отметить, что данная система является искусственной, позволяющей формально систематизировать накопленные данные. Самая большая группа на настоящий момент 0 пептидов представлена пептидами, формирующими амфнпатические аспиралн в липидном окружении, но обычно неупорядоченными в водных растворах. Спиральная структура часто представлена в виде спиральповоротспираль, где первые 9 аминокислотных остатков формируют гидрофильный спиральный участок рядом с концом, далее остатка глицин иили пролин участвуют в повороте и следующие аминокислот образуют гидрофобную спираль у Сконца . Это линейные молекулы, не содержащие цистеина. Сюда относят цекропины, первоначально выделенные из иммунизированной гемолимфы куколки i. Последующие исследования показали наличие таких пептидов в гемолимфе многих видов насекомых x, i i. В соответствии с аминокислотной последовательностью выделяют три вида цекропинов А, В и . Рис. В г. Факт обнаружения пептидов этого класса в таких эволюционно отдаленных группах животных свидетельствует как об их древнем происхождении, так и особой функциональной значимости в обеспечении резистентности к инфекции. I vi цекропины А и В очень активны против грамположмтельных и грамотрицательных бактерий, тогда, как цекропин только против грамотрицательных , , . Более оенбвные представители семейства цекропинов А и В обладают повышенной антимикробной активностью по сравнению с менее катионным цекропииом , в молекуле которого на 3 положительных заряда меньше , . Изученные пептиды обладают низкой цитотоксичностью в отношении эукариотических клеток. Цекропин X V II V i . Цекрогшн В I I IVI V i . Цекропин . Рис. Первичная структу ра цекропинов цит. В.Кокрякову, . Уникальные пептидные антибиотики найдены в репродуктивных органах некоторых насекомых. У i вырабагывается андропин Вошап , , . Он состоит из аминокислот, формирующих две аспирали, его ген примыкает к кластеру генов, кодирующих цскропины. Этот ген акгивируется при спаривании, а не при инфекционном заражении, и экспрессируется только у зрелых самцов. Из репродуктивных органов самки i были выделены два пептида цератотоксины. Они обладают большой структурной гомологией с цекропинами и проявляют антибактериальную и гемолитическую активность ii . В коже амфибий находится большое количество желез, вырабатывающих биологическиактивные пептиды. В г. X vi магейнины, которые активны i vi против грамположительных, грамотрицательных бактерий, грибков и простейших . В микробоцидных дозах эти пептиды не цитотоксичны в отношении эритроцитов и лимфоцитов, однако, к их литическому действию оказались повышенно чувствительны трансформированные опухолевые клетки. Видимо магейнины оказались уникальными для X, т. Цекропины и магейнины проявляют активность против эукариотических одноклеточных паразитов . Цекропин является пока единственным пептидом, воздействующим на многоклеточного паразита i i нематоду, вызывающую филляриоз человека обзор Viii, , . У млекопитающих пептиды этого класса обнаруживаются среди семейства кателицидинов. Это единственный кателицидин человека .