Закономерности тепловой агрегации глобулярных олигомерных белков

• Автор: Голуб, Николай Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Агрегация белков.

1.2. Митохондриальная аснартатаминотрансфераза из сердца свиньи

1.3. ГлицеральдегидЗфосфатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика.

1.4. Алкогольдегндрогеназа I из vii.

1.5. Кристаллин хрусталика глаза быка

1.5.1. Влияние УФоблучения на структуру и агрегацию кристаллина

1.6. Молекулярные шанеронм.

1.6.1. Структура и функции акристаллина
1.6.2. Структура и функции
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Выделение и очистка митохондриальной аспартатаминотрансферазы.3
2.1.2. ГлицеральдегидЗфосфатдегидрогеназа.
2.1.3. Алкогольдегидрогсназа 1 из vii
2.1.4.Шаперон .
2.1.5.Выделение и очистка а и i кристаллинов.
2.2. Методы исследования.
2.2.1.Электрофоретический анализ белков в ААГ.
2.2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДСК
2.2.3. Динамическое квазиэластичное светорассеяние
2.2.4. Изучение кинетики тепловой агрегации белков методом динамического светорассеяния
2.2.5. УФоблучение Зкристаллина
2.2.6. Определение активности митохондриальной аспартатаминотрансферазы
2.2.7. Термоинактивация митохондриальной аспартатаминотрансферазы ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Тепловая инактивация, денатурация и агрегация митохондриальной аспартатаминотрансферазы
3.1.1 .Тепловая денатурация и инактивация митохондриальной
аспартатаминотрансферазы.
3.1.2.Тепловая агрегация митохондриальной аспартатаминотрансферазы.
3.2. Влияние акристаллина на тепловую агрегацию митохондриальной аспартатаминотрансферазы
3.3. Изучение стадии образования стартовых агрегатов на примере тепловой агрегации глнцеральдсгидЗфоефатдсгидрогеназы
3.4. Влияние вгоЕЬ на тепловую агрегацию ГАФД
3.5. Доказательство наличия шанероноподобной активности у дрожжевой алкогольдсгидрогсиазы 1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Понимание механизма защитного действия шаперонов различных классов может служить основой для поиска аптиагрегационных агентов, которые, подобно шаперонам, будут оказывать защитное действие путем уменьшения вероятности слипания сталкивающихся частиц. Агенты подобного рода могут найти применение при решении биотехнологических задач и при создании препаратов медицинского назначения. ГЛАВА 1. Глобулярные белки белки, в молекулах которых полипептидные цепи плотно свернуты в компактные глобулы. Глобулярная структура белков обусловлена гидрофобногидрофильными взаимодействиями. К глобулярным белкам относятся ферменты, антитела, некоторые гормоны, шапероны и другие биологически активные белки. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядочспная пространственная структура конформация, которая способствует выполнению специфических биологических функций. Цель диссертационной работы состоит в том, чтобы выявить кинетические закономерности и механизм тепловой агрегации глобулярных олигомерных белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов, в отсутствие и в присутствии шаперонов. В качестве субстратов при изучении тепловой агрегации белков использовались митохондриальная аспартатаминотрансфераза мААТ, глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа ГАФД и УФоблученный 3кристаллин. В качестве шаперонов, подавляющих агрегацию белков, использовались акристаллин, ОгоЕГ и дрожжевая алкогольдегидрогеназа АДГ I. В связи с поставленными в диссертационной работе задачами в обзоре литературы обсуждаются механизмы агрегации белков, а также структура, физикохимические свойства и функциональные особенности мААТ, ГАФД, АДГ I, 3кристаллина, акристаллина и ОгоЕЬ. Индуцировать агрегацию белков в клетках могут различные воздействия, и, прежде всего, тепловой и окислительный стрессы. I vi нативные белки разворачиваются в результате тепловой денатурации, а также под действием денатурирующих агентов, таких как гуанидин гидрохлорид или мочевина. Частично или полностью развернутые белки могут взаимодействовать между собой, в основном посредством контактов гидрофобных поверхностей, с образованием аморфных или амилоидных агрегатов i, i, , . Образующиеся структурированные или аморфные аг регаты i, Маркосян и Курганов, характеризуются низкой растворимостью в воде или детергентах и ненативной вторичной структурой i, . Основные модели агрегации белков были предложены Спидом и др. . Эти модели включают Л последовательную частицакластерную i агрегацию при которой мономер присоединяется к растущему агрегату Б мультимерную, кластеркластсрную агрегацию, когда олигомеры разных размеров ассоциируют быстрее последовательного присоединения мономеров к растущему агрегату и В нуклеацию, предшествующую стадии роста агрегата, характеризующуюся относительно медленной стадией формирования ядра и затем переходящую в быстрый рост агрегата рисунок 1. Согласно последней модели, получившей наибольшее признание, образовавшееся ядро растет путем присоединения мономеров денатурированных молекул белка. При этом размер агрегата приближается к предельному значению, когда денатурированный белок исчерпан. Механизм агрегации белков путем нуклеации предложен для образования амилоидных фибрилл , . Рисунок 1. Возможные механизмы агрегации белков . Механизм образования аморфных агрегатов оставался невыясненным. В работах лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на основании изучения кинетики тепловой агрегации глобулярных олигомерных белков кристаллина из хрусталика глаза быка, ГАФД из скелетных мышц кролика, белка оболочки вируса табачной мозаики и дрожжевой АДГ I предложен новый механизм тепловой агрегации, ведущей к образованию аморфных агрегатов. Предложенный механизм включает в себя стадию образования стартовых агрегатов первичных кластеров и дальнейшие стадии слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка v , i , i v . Исследования проводились в широком диапазоне температур и концентраций белков методом динамического светорассеяния.