Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны

• Автор: Анисимова, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ФОСФОЛИПИДЫ ВАЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН

1.1. Структура и свойства фосфолипидов .

1.2. Биосинтез фосфолипидов и его регуляция.

1.3. Участие фосфолипидов в секреции белков.

1.3.1. Взаимосвязь секреции с обменом фосфолипидов.

1.3.2. Доказательства участия фосфолипидов в секреции белков, выявленные с помощью мутантных штаммов.
1.3.3. Взаимодействие фосфолипидов с топогенными последовательностями секретируемого белка

1.3.4. Влияние фосфолипидов на функционирование компонентов секреторного аппарата

1.4 Участие фосфолипидов в репликации ДНК.
1.5. Роль фосфолипидов в биогенезе клеточной оболочки.
1.6. Участие фосфолипидов в фолдинге белков.
1.7. Возможное участие фосфолипидов в регуляции экспрессии генов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования
2.3. Выделение гшазмидной ДНК.
2.4. Полимеразная цепная реакция
2.5. Трансформация клеток Е. соИ плазмидной ДНК.
2.6. Элиминация плазмиды р из клеток штамма АЕ.
2.7. Выделение суммарной РНК
2.8. Включение метки в 5 конец олигонуклеотидного зонда.
2.9. Нозернблотгибридизация.
2 Анализ динамики превращения импульсно меченого предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму
2 Анализ синтеза РНК.
2 Иммуноферментный анализ щелочной фосфатазы.
2 Иммуноферментный анализ липопротеина.
2 Анализ фосфолипидного состава мембран
. Экстракция липидов.
. Тонкослойная хроматография.
. Определение липидного фосфора
2 Электрофорез белков
2 Аналитические методы.
. Определение активности щелочной фосфатазы
. Определение активности галактозидазы
. Определение содержания белка.
. Определение 2кетоЗдезоксиОманнооктоната.
. Определение содержания экзополисахаридов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. УЧАСТИЕ ФОСФАТИДИЛГЛИЦЕРИНА В СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ЧЕРЕЗ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ К
3.1. Инактивация гена приводит к нарушению фосфолипидного состава мембран . i
3.2. Инактивация гена снижает эффективность секреции щелочной
фосфатазы через цитоплазматическую мембрану . i
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ НА СЕКРЕЦИЮ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ И НА БИОГЕНЕЗ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ ОБОЛОЧКИ.
4.1. При инактивации гена увеличивается секреция щелочной фосфатазы через внешнюю мембрану
4.2. Изменение содержания анионных фосфолипидов мембран влияет на содержание и биогенез компонентов клеточной оболочки.
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН НА
ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА рИоА.
5.1. Биосинтез щелочной фосфатазы подавляется при инактивации гена .
5.2. Инактивация гена влияет на динамик репрессии синтеза щелочной фосфатазы.
5.3. Экспрессия генов под контролем Ррно промотора подавляется при изменении фосфолипидного состава мембран.
5.4. Влияние фосфолипидного состава мембран на экспрессию гена рИоА
на уровне транскрипции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Экспрессия генов под контролем Ррно промотора подавляется при изменении фосфолипидного состава мембран. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов секреции и экспрессии белков является важным фундаментальным исследованием, а также необходимым условием для создания научных основ технологии микробиологического производства ферментов. Транслокация белка из цитоплазмы в специфические компартменты клетки, или секреция, является основой многих процессов биогенеза и сборки экзобелков и супрамолекулярных структур клеточной оболочки, регуляции метаболизма, а также взаимодействия клеток с окружающей средой. В настоящее время имеются значительные достижения в установлении основ этого процесса, однако, полностью понять его механизм невозможно без учета динамических особенностей структуры и метаболизма мембранных фосфолипидов, без рассмотрения экспрессии генов и секреции белков как части биогенеза клеточной оболочки, в котором фосфолипиды участвуют в качестве метаболических предшественников ее компонентов. Состояние проблемы. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, свидетельствующих об участии как анионных . Vi . V V, i, , так и цвиттерионного фосфатидилэтаноламина i, i, iv . Эти результаты подтверждают гипотезу о важной роли фосфолипидов мембран в секреции белков, впервые высказанную М. А. Несмеяновой v, . Показано, что для функционирования белковых компонентов секреторного аппарата требуются анионные фосфолипиды АФЛ i , i, i, . Они также взаимодействуют с положительно заряженным концевым участком сигнального пептида предшественников белков при инициации секреции v, v , ix . Цвиттерионный фосфолипид фосфатидилэтаноламин участвует в секреторном процессе путем формирования небислойной структуры мембран, которая способствует транслокации белка через мембрану iv . Головастов и др. Недавно также показано, что этот фосфолипид взаимодействует с концевой областью зрелой полипептидной цепи, помогая, как предполагается, ее входу в транслокационный канал Головастов и др. Кроме того, было установлено, что дисбаланс фосфолипидов, вызванный отсутствием фосфатидилэтаноламина, влияет не только на секрецию щелочной фосфатазы , но и на экспрессию ее гена, контролируемого собственным промотором Ррно iv . Однако вклад индивидуальных классов фосфолипидов в экспрессию генов и секрецию белков, а также молекулярный механизм их вовлечения в эти процессы остаются мало изученными. Ранее в лаборатории М. А. Несмеяновой были получены первые косвенные доказательства участия анионного фосфатидилглицерина ФГ в секреции щелочной фосфатазы . Евдокимова, Несмеянова, Несмеянова, Евдокимова, . Его содержание и обмен увеличивались в процессе секреции белка, и именно он был обнаружен в транслокационном сайте мембран Богданов и др. Ь. Позднее участие ФГ в секреции белков было подтверждено в опытах i vi Vi . Однако прямые доказательства участия этого фосфолипида в секреции белка у бактерий i viv отсутствуют. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось установление роли индивидуальных классов фосфолипидов мембран в секреции щелочной фосфатазы и экспрессии ее гена у . В качестве модели для решения конкретных задач исследования использовали щелочную фосфатазу . Биогенез этого белка включает его синтез в цитоплазме в виде предшественника, содержащего на конце дополнительную последовательность, называемую сигнальным пептидом транслокацию предшественника через цитоплазматическую мембрану с использованием зависимого секреторного пути процессинг отщепление сигнального пептида сигнальной пептидазой на внешней стороне цитоплазматической мембраны и посттранслокационную модификацию в периплазме с образованием активной формы фермента. Изучить влияние инактивации гена , ответственного за синтез фосфатидилглицерина у . Изучить влияние изменений в фосфолипидном составе мембран, вызванных мутациями в генах фосфолипидного обмена и , ответственных за синтез ФГ и ФЭ, соответственно, на экспрессию гена щелочной фосфатазы. Научная новизна работы. В настоящей работе с использованием мутантных штаммов .