Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5(2.7.4.13): выделение и свойства белка, идентификация и клонирование гена

• Автор: Микулинская, Галина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Организация ферментов биосинтеза дНТФ.

1.1.1. Биосинтез дНТФ в клетках Е.соИ, инфицированных бактериофагом Т4

1.1.2. дНТФсинтезирующис комплексы ДСК.

1.1.3. Связь ДСК с репликационным аппаратом.

1.1.4. Организация ферментов биосинтеза дНТФ в других организмах

1.2. Особенности физиологии бактериофага Т5.

1.2.1. Общие черты бактериофага Т

1.2.2. Особенности структуры ДНК

1.2.3. БЭТмеханизм транспорта ДНК в клетку.

1.2.4. Регуляция транскрипции генов.
1.2.5. Разрушение ДНК клеткихозяина
1.2.6. Ферменты биосинтеза дНТФ.
1.2.7. Степень изученности генома бактериофага
1.3. Дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5.
1.3.1. Роль фермента в метаболизме
1.3.2. Описание фермента и его свойства.
1.3.3. Пространственная структура нуклеозидмонофосфаткиназ
1.3.4. Структурные основы субстратной специфичности.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Микробиологические методы
2.1.1.Штаммы бактерий, бактериофаги, плазмиды и среды.
2.1.2. Получение бактериофага Т5 в высоком титре
2.1.3. Получение биомассы клеток Е.соИу инфицированных бактериофагом Т5
2.2. Аналитические методы.
2.2.1. Метод определения белка
2.2.2. Электрофорез белков в ПААТ .
2.2.3. Определение Ыконцсвой последовательности аминокислот
2.2.4. Изоэлектрофокусирование
2.2.5. Определение молекулярной массы дНМФкиназы бактериофага Т5.
2.3. Определение активности дНМФкиназ
2.3.1. Хроматографический метод.
2.3.2. Спектрофотометрический метод.
2.3.3. Тестирование активности методом тонкослойной хроматографии .
2.4. Методы очистки дНМФкиназы бактериофага Т5.
2.4.1. Приготовление клеточного экстракта.
2.4.2. Удаление нуклеиновых кислот
2.4.3. Фракционирование сульфатом аммония.
2.4.4. Ионообменная хроматография.
2.4.5. Аффинная хроматография.
2.5. Методы молекулярной биологии.
2.5.1. Выделение ДНК
2.5.2. Гидролиз ДНК.
2.5.3. Лигирование фрагментов ДНК.
2.5.4. Полимеразная цепная реакция
2.5.5. Определение первичной последовательности ДНК.
2.5.6. Праймеры.
2.5.7. Получение компетентных клеток и их трансформация.
2.5.8. Скрининг рекомбинантных клонов.
2.5.9. Экспрессия рекомбинантных плазмид
2.5 Гибридизация ДНК бактериофагов с зондом.
2.6. Компьютерные методы
2.6.1. Анализ нуклеотидных последовательностей
2.6.2. Анализ аминокислотных последовательностей
2.6.3. Определение потенциальной пространственной структуры белка.
2.7. Методы биотехнологии.
2.7.1. Иммобилизация дНМФкиназы бактериофага Т
2.7.2. Синтез дНТФ при помощи ИФП дНМФкиназы бактериофага Т5.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение и очистка дНМФкиназы бактериофага Т
3.1.1. Очистка дНМФкиназы
3.1.2. Физикохимические свойства белка.
3.1.3. Определение Мконцсвой последовательности аминокислот
3.2. Структурная организация фрагмента ранней области С генома бактериофага Т5 ,5 генома.
3.2.1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности
3.2.2. Локализация генов и открытых рамок считывания и анализ потенциальных функций их продуктов
3.2.3. Потенциальные регуляторные элементы.
3.2.4. Клонирование гена и его экспрессия
3.2.5. Идентификация продукта гена лизоцима
3.3. Функциональная характеристика гена .
3.3.1. Клонирование гена и его экспрессия в .i.
3.3.2. Очистка рекомбинантной дНМФкиназы и ее свойства
3.3.3. Анализ потенциальной структуры фермента.
3.3.4. Ферментативный синтез дезоксирибоаденозннатиотрифосфата дАТФа
3.4. Исследование широкоспецифичных киназ других бактериофагов
3.4.1. Ген бактериофага фСЗ 1 клонирование и экспрессия в .i
3.4.2. Ген кодирует дНМФкиназу широкой специфичности.
3.4.3. Бактериофаг Т4типа также кодирует дНМФкиназу.
3.4.4. Анализ строения фаговых киназ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
гмдЦМФ гидроксиметилдезоксирибоцитидин5монофосфат
дАДФ дезоксирибоаденозин5дифосфат
дЛТФ дсзоксирибоаденозин5трифосфат
дГМФ дезоксирибогуанозин5монофосфат
дНДФ дезоксирибонукпеозиддифосфат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ дезоксирибонуклеозидтри фосфат
дТМФ дезоксириботимидин5монофосфат
ДЕАЕ диэтиламиноэтил
ДСКдНТФсинтезирующий комплекс
ДСН додецилсульфат натрия
ИФП иммобилизованный ферментный препарат
ИГПТ изопропилтиоМЗгалакгозид изопропил1 тиорОгалактопиранозид кДа килодальтон КФ Классификация Ферментов мМ миллимоль концентрация
НАДН никотинамидадениндинуклеотид нм нанометр длина волны
ФЕП фосфоенолпируват ПААГ полиакриламидный гель ПЦР полимеразная цепная реакция ТБАВг бромид трибутиламмония Трис трисгидроксиметиламинометан т.п.н. тысяча пар нуклеотидов ЭДТА этилендиаминтетраацетат .i ii i, кишечная палочка
Введение


Кроме того, широкая специфичность фермента бактериофага Т5 потенциальный источник знаний о молекулярных основах взаимодействия белоксубстрат, ключ к пониманию структурных основ специфичности киназ. Особое значение приобретает исследование широкоспецифичной киназы бактериофага Т5 в связи с потенциальным использованием такого фермента в технологии энзиматического синтеза дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, которые в настоящее время широко используются в научных исследованиях и в медицине. Целью настоящей работы явилось структурнофункциональное и генетическое исследование дНМФкиназы бактериофага Т5, а также выявление новых дНМФкиназ широкой специфичности. К моменту начала работы данный фермент был частично очищен , , что позволило авторам определить ряд его биохимических свойств относительную скорость реакции, субстратную специфичность, константы Михаэлиса для различных субстратов и константы ингибирования. При этом невысокая степень очистки не позволила авторам определить молекулярную массу фермента и его удельную активность. Кроме того, отсутствовали данные о первичной структуре гена. Ранее неоднократно предпринимались попытки шотганклонироваиия фрагментов генома бактериофага Т5, но они не дали результата применительно к ранней области генома, в которой находится ген . Выделить и очистить до гомогенного состояния дНМФкиназу бактериофага Т5 из инфицированной фагом биомассы . Ссквснировать область генома бактериофага Т5, содержащую ген , кодирующий фермент, и идентифицировать ген, пользуясь данными о ферменте. Клонировать ген и экспрессировать его в . Провести анализ компьютерных баз данных на основании полученной информации о структуре киназ с целью поиска гомологичных ферментов из других источников. В настоящей работе впервые описан процесс очистки дНМФкиназы бактериофага Т5 до гомогенного состояния из инфицированной фагом биомассы . Выполнены секвенирование фрагмента области С генома бактериофага, содержащего ген , и его описание включающее открытые рамки считывания, потенциальные промоторы и терминаторы транскрипции. Ген идентифицирован и клонирован в плазмиду с эффективным промотором. Рекомбинантная дНМФкиназа бактериофага Т5 очищена из клеток штаммапродуцента с высоким выходом двумя альтернативными способами. На основании полученной информации о первичной структуре дНМФкиназы Т5 сделано предположение о возможной пространственной структуре белка. В рамках исследования фаговых дНМФкиназ выделен и клонирован ген новой дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы широкой специфичности, кодируемой бактериофагом фСЗ 1. Биосинтез дНТФ в клетках . Т4 Ферменты, участвующие в метаболизме предшественников ДНК, дсзоксирибонуклеозидтрифосфатов, обеспечивают в клетках любого организма, в том числе организма человека, сбалансированность пула дНТФ. Концентрации и соотношения дНТФ та составляющая гомеостаза, нарушение которой может повлечь за собой необратимые последствия. Так, для различных организмов показано, что изменение пула дНТФ усиливает мутагенез i , , . Предполагают, что именно чувствительность обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека к дисбалансу пула дНТФ может являться причиной пптервариабельности вируса Vi . Разница пулов дНТФ предопределяет различное проявление активности вирусов в разных типах клеток ii . Изменение характера биосинтеза дНТФ имеет место при развитии апоптоза, индуцирует гибель клеток . Неудивительно, что мишенью большинства существующих и разрабатываемых противоопухолевых агентов являются ферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот рибонуклеотидредуктаза , , . Отличной моделью для изучения биосинтеза дНТФ служат бактериофаги. Для метаболизма вирулентного фага характерна высокая скорость и четкая регуляция. Так, при инфекции ii i колифагом количество вновь синтезированной ДНК превышает количество ДНК клеткихозяина примерно в 4,5 раза , , а скорость синтеза ДНК возрастает до раз . Для того, чтобы обеспечить синтез большого количества ДНК за короткое время, Тчстный бактериофаг Т4 на использует для синтеза своей ДНК дНТФ, образующиеся путем деградации ДНК клеткихозяина, но остальные дНТФ синтезируются v .