Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа : Взаимодействие с антителами, нуклеиновыми кислотами и распределение фермента в клетке

• Автор: Арутюнова, Елена Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 188 с. : ил

Оглавление

Список сокращений.

Введение

Обзор литературы.

глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа основные свойства и функции

Особенности строения и механизм катализа.

Ацилфосфатазная активность ГАФД

ГлицеральдегидЗфосфатдегиярогеназа многофункциональный

УрацилДНКгликозилазная активность ГАФД.

Связывание ГАФД с нуклеиновыми кислотами.

Участие ГАФД в апоптозе

Глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа и нейродегенеративные
заболевания
Взаимодействие ГАФД с белками цитоскелета
Фузогенная активность ГАФД.
Антитела структура,очистка и применение
Структура иммуноглобулинов.
Взаимодействие с антигеном.
Методы аффинной очистки антител
Аффинная очистка с использованием иммобилизованного антигена.
Аффинная очистка с помощью антиантител
Бактериальные рецепторы.
i подобные белки.
Металлоаффинная хроматография.
Тиофилъные взаимодействия.
Лектинаффинная хроматография.
Применение антител
Исследование фолдинга белков с помощью антител
Материалы и методы
Материалы
Выделение ГАФД i i из клеток Е. i, штамма
9 трансформированных плазмидой II
Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика
Определение концентраций реагентов
Определение концентрации белков в растворе
Определение концентрации иммобилизованных белков
Определение активности ГАФД.
Получение апоГАФД
Иммобилизация белков на сефарозе 4В.
Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров Г АФД из
мышц кролика
Электрофорез в денатурирующих условиях
Дифференциальная сканирующая калориметрия.
Регистрация спектров кругового дихроизма
Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител
Иммунизация кроликов
Определение титра антител по методу Ухтерлони.
Определение титра антител на ГАФД и в сыворотке с помощью твердофазного иммуноферментного анализа I.
Очистка сыворотки методом высаливания
Очистка антител на различные формы ГАФД
Определение уровня перекрестной реакции между антителами с
помощью метода иммунопреципитации i
Инкубация ГАФД Я5с антителами при .
Изучение связывания ГАФД кролика с нуклеиновыми кислотами
Выделение тотальной ДНК из клеток дрожжей
vii.
Выделение суммарной транспортной РНК.
Введение аРсАТР в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК
полимеразы 1.
Включение уР в составе АТФ в РНК.
Связывание ГАФДк с меченой ДНК и РНК.
Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках в процессе апоптоза
Выращивание культуры клеток
Выявление субклеточной локализации ГАФД и актина в клетке
Результаты и их обсуждение Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител к ГАФД
Иммунизация кроликов.
Определение титра антител по Ухтерлони.
Определение титра антител с помощью метода I
Очистка антител на разные формы ГАФД методом аффинной
хроматографии.
Определение уровня перекрестной реакции между антителами на тетрамеры и антителами на денатурированную форму
Влияние антител на процесс реактивации ГАФД .
Влияние антител на тетрамеры и антител на денатурированную форму ГАФД на активность фермента
Влияние антител на активность холоГАФД.
Влияние антител на активность апо Г4ФД.
Выделение комплекса ГАФД Вантитело и его анализ методом
дифференциальной сканирующей калориметрии.
Изучение скорости связывания антител на тетрамеры с ГАФД .Л Влияние фракции антител на денатурированную форму на активность
ГАФД при С.
Влияние антител на стабильность ГАФД при
Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на
стабильность холоГАФД при .
Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на
стабильность апоГАФД при
Изучение влияния антител на тетрамеры на стабильность апоГАФД при методом ДСК.
Взаимодействие ГАФДк с нуклеиновыми кислотами
Влияние окисления ГАФД на взаимодействие фермента с
нуклеиновыми кислотами
Влияние связывания ГАФДк с нуклеиновыми кислотами на олигомерность фермента
Изучение субклеточной локализации ненативных форм ГАФД в клетках в норме и в процессе апоптоза
Субклеточная локализация ненативной Г АФД и ее взаимодействие с
актином в клетках
Изучение локализации ненативной формы ГАФД в клетках в процессе апоптоза.
Выводы.
Список литературы


Такая сложная система междоменных взаимодействий создает предпосылки для различных проявлений функционального взаимодействия субъединиц в составе олигомера, важнейшими из которых являются кооперативность по связыванию и так называемая полуцентровая реактивность неэквивалентность активных центров при взаимодействии с некоторыми аналогами субстрата или ингибиторами. Первые сведения, демонстрирующие явление отрицательного гомотропного взаимодействия на примере связывания кофактора, были получены при исследовании изменений дисперсии оптического вращения дегидрогеназы в результате ее взаимодействия с кофактором. Небольшие сдвиги в параметрах дисперсии оптического вращения вызывает добавление первого эквивалента , связывание последующих молекул вызывает изменения, выраженные в меньшей степени i I. Неравноценность связывающих участков, индуцируемая коферментом, следует также из отличий в скорости присоединения четырех последовательно связывающихся эквивалентов если первая молекула кофермента взаимодействует с ГАФД за время, меньше 3 мсек. Константы диссоциации для первого и второго участков связывания составляют 5х М метод ультрацентрифугирования и п 9М метод равновесного диализа, для третьего участка, определенные этими же методами 4x1 6 М и 3x7 М, соответственно, для четвертого x М и х 1 ОМ Vi . Изучению параметров связывания с ГАФД посвящено меньшее число работ. Изза неспособности образовывать комплекс с переносом заряда с 9, он обладает меньшим сродством к
ферменту. Методом флуоресцентной спектроскопии были определены константы диссоциации, равные 0,5 мкМ для участков прочного связывания и 1 мкМ для участков непрочного связывания , , V В. Не смотря на сходство третичной структуры, ГАФД из различных источников обнаруживает различный характер кооперативности при связывании кофермента. В случае дрожжевого фермента отрицательная кооперативность связывания наблюдается лишь в определенных условиях температура С и 8,5, при физиологических условиях фермент, в отличие от дегидрогеназы, выделенной из мышц, обнаруживает положительную кооперативность. Повидимому, характер кооперативности определяется особенностями четвертичной структуры фермента. Возможность существования взаимосвязи между механизмами, лежащими в основе разных проявлений неэквивалентности активных центров в составе тетрамерной молекулы ГАФД, остается одной из важных и обсуждаемых проблем. Согласно концепции, предложенной Левицким, как полуцентровая реактивность, так и отрицательная кооперативность по связыванию коэнзима являются результатом конформационных изменений, индуцируемых взаимодействием лиганда или полуцентрового реагента с районом активного центра, связывающим аденозиновую часть молекулы коэнзима и передающихся на соседние субъединицы vii . Альтернативная модель, развитая в работах Бернхарда и соавт. ГАФД, организованной, как димер димеров такая структурная особенность может также объяснить резкие проявления отрицательной
кооперативности по связыванию коэнзима i , , . Выяснению молекулярных механизмов эффектов отрицательной кооперативности и полуцентровой реактивности посвящены ряд работ . Это связано с относительной ограниченностью имеющейся структурной информации, так как рентгеноструктурные данные высокого разрешения для тройного комплекса фермент субстрата пока не получены. Реакция окисления глицеральдегид 3 фосфата протекает следующим образом на первой стадии происходит связывание кофермента в активном центре, которое сопровождается появлением полосы поглощения при нм полосы Рэкера за счет образования комплекса с переносом заряда между группой 9 цистеина и . Остаток Су 9 в данном случае выступает в качестве донора электрона, а пиридиновое кольцо в качестве акцептора I. Субстрат взаимодействует с группой 9 остатка цистеина с образованием тиополуацеталя, полоса Рэкера при этом исчезает. Затем происходит перенос гидридиона от связанного субстрата на с образованием тиоэфира и восстановленного . Для осуществления следующего этапа необходима замена на . Связывание , повидимому, приводит к конформационным перестройкам в молекуле дегидрогеназы, которые необходимы для фосфоролиза ацил фермента, при котором происходит образование 1,3 дифосфоглицериновой кислоты . Совокупность данных по химической модификации и рентгеноструктурному анализу указывает на участие в каталитическом




он

4
неорганический



о
Рис. СН0НСНР2.