Молекулярно-генетическое изучение мышечной дистрофии Дюшенна в Башкортостане

• Автор: Гринчук, Олег Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 127 с. : ил

1.ВВЕДЕНИЕ
1.1.Актуальность работы
1.2.Цель и задачи исследования
1.3.Научная новизна
1.4.Практическая значимость
1.5.Положения, выносимые на защиту
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ П
2.1. Общая характеристика МДД и МДБ
2.2.Идентификация гена МДД
2.3.Биохимия и патофизиология мышечных дистрофий Дю-шенна и Беккера. Характеристика дистрофина и ассоциированного с ним гликопротеинового комплекса
2.4.Методы выявления делеций в гене дистрофина. Прямая ДНК-диагностика МДД/МДБ
2.5.Характеристика делеций и дупликаций, их спектры в популяциях
2.6.Корреляция тяжести заболевания и типа делеций в гене дистрофина
2.7.Делеционные точки разрыва в гене дистрофина. Механизмы возникновения делеций
2.8. Точковые мутации в гене дистрофина и методы их регистрации

2.9.Молекулярно-генетическая диагностика МДД: прямые и косвенные методы.
3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Выделение геномной ДНК
3.2.Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3.2.1.Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мПЦР)
3.2.2. Тонкое картирование ДТР в 3 - “горячем ” участке гена дистрофина и молекулярно-генетическая диагностика
3.3. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
3.4.БЗСР-анали з
3.5.Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1.Клиническое описание больных МДД
4.2.Анализ делеций в гене дистрофина. Спектр делеций и распределение делеционных точек разрыва в гене дистрофина у больных МДД Башкортостана
4.3. Корреляция клинических симптомов у пациентов МДД с характером делеций в гене дистрофина
4.4. Тонкое картирование делеционных точек разрыва в 3-“горячей ” области возникновения делеций в гене дистрофина
4.5.Разработка системы мультиплексных БЗСР для поиска полиморфизмов и точковых мутаций в гене дистрофина
4'.6.Молекулярно-генетическая диагностика в семьях высокого риска МДД Башкортостана. Практическое применение анали-

анализа делеций в гене дистрофина: подтверждение диагноза МДД и определение статуса носителъства. Косвенная диагностика
4.7. Создание компьютерной системы Мышечная дистрофия Дюшенна/ Беккера”
4.7.1.Разработка формализованной карты обследования на мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера
4.7.2.Создание автоматизированного регистра по мышечной дистрофии Дюшенна в республике Башкортостан
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

60°C - 45секунд,
72°C - 45секунд.
После 32-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут.
Оптимальное молярное содержание MgCl2 в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой используемой пары олигопраймеров. При проведении мПЦР использовали 6.7 шМ MgCl2.
При анализе распределения делеционных точек разрыва в гене дистрофина учитывалось, что 5'-“горячий”район затрагивает 2-19 экзоны, а 3’-“горячий” - 42-60 экзоны. Для удобства сравнения ген дистрофина был подразделен на следующие интервалы: интроны перед экзоном 6; интроны между экзонами 6-8; 8-19; 19-42; 42-44; 44-45; 45-47; 47-48; 48-50; 50-52 и интроны после экзона 52.
Влияние делеции на трансляционную рамку считывания определяли при сравнении фазы 5'-границы первого делегированного экзона с фазой 5'-границы первого последующего экзона, не затронутого делецией. Данные об экзон/интронных границах в гене дистрофина приведены в работах: Monaco et al., 1988, Malhotra et al., 1988, Chamberlain et al., 1988, Koenig et al., 1989, Baumbach et al., 1989, Roberts et al., 1992).
3.2.2.Тонкое картирование ДТР в 3'-“горячем” участке гена дистрофина и молекулярно-генетическая диагностика
В нашей работе картирование ДТР в 3'-“горячем” участке гена дистрофина проводилось в 3 этапа:
I. Стандартный мПЦР-скрининг позволяет локализовать ДТР в области интронов между амплифицирующимися и делегированными экзонами.
II. Анализ с помощью обычной ПЦР с одной парой праймеров внутриинтронных локусов, фланкирующих делетированные/неделетированные экзоны, а именно - внутригенных маркеров в 44 - (STR-44), 45 - (STR-45), 49 -(STR-49), 50 - (STR-50) интронах гена (Clemens et al., 1991).