Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью

• Автор: Гладилина, Юлия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение

1. Аспарагиназа как противолейкозный препарат обзор литературы IО

1.1. Бактериальные аспарагиназы и история их изучения

1.2. Структурнофункциональные особенности аспарагиназы

1.3. Физикохимические свойства

1.4. Гидролиз аспарагина определяет противоопухолевое

действие аспарагиназы

1.5. Глутаминазная активность основная причина токсичности аспарагиназы

1.6. Современные терапевтические аспарагиназы

1.7. Актуальность разработки лекарственного препарата на основе аспарагиназы без глутаминазной активности
2. Материалы и методы
2.1. Генноинженерные методы клонирования и экспрессии
2.2. Выделение рекомбинантного фермента методом колоночной хроматографии
2.3. Физикохимическая характеристика аспарагиназы
2.3.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле
2.3.2. Изоэлектрофокусирование
2.3.3. Определение аспарагиназной активности
2.3.4.Определение концентрации белка.
2.3.5.0прсделение температуры денатурации фермента
2.3.6.Определение стабильности фермента в растворе мочевины
2.3.7.0пределение стабильности фермента при многократных циклах замораживания оттаивания
2.4. Определение равновесных кинетических констант
2.5. Определение цитотоксической активности аспарагиназы
2.6. Определение перекрестной иммуноспецифичности аспарагиназ
2.6.1.1 олучение специфических поликлональных антител
2.6.2. Определение уровня выработки антител методом прямого иммуноферментного анализа ИФЛ
3. Результаты и обсуждение
3.1 Получение рекомбинантного штаммапродуцента рА
3.1.1. Клонирование гена НрА
3.1.2. Оптимизация генетической конструкции для
экспрессии НрА в клетках Е.со
3.1.3. Характеристика рекомбинантного штамма продуцента
3.1.4. Экспрессия рекомбинантной НрА
3.2. Выделение аспарагиназы НрА
3.3. Характеристика рекомбинантной НрА
3.3.1. Физикохимические свойства
3.3.2. Каталитические свойства
3.3.3. Цитотоксическая активность
3.3.4. Перектестная антигснность НрА и ЕсА
3.4. Возможности практического применения НрА
Выводы
Приложение 1
Список литературы


Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать исчерпание внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной активности фермента. i и соавт. i . Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является актуальной задачей медицинской биологии. Получение низкотоксичной аспарагиназы является особенно необходимым у нас в стране. В целях уменьшения потребности в сопроводительной терапии и трансфузиях компонентов крови современные отечественные протоколы лечения лейкозов предполагают отказ от высокодозной интенсивной химиотерапии. Напротив, разработанные оригинальные протоколы, как например Москва Берлин ОЛЛМЬ , используют длительное, в течение нескольких месяцев, применение аспарагиназы в малых дозах v i . В связи с этим возникают новые требования к препарату аспарагиназы, главным из которых является его низкая токсичность. Применяемые в настоящее время терапевтические аспарагиназы, которые были введены в клиническую практику более лет назад, не удовлетворяют современным требованиям к этим препаратам. Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность фермента. Глутаминазная активность наиболее удачного мутанта ЕсА 8 была снижена в 2 раза по сравнению с ферментом дикого штамма. . Однако аспарагиназная активность этого производного ЕсА также была снижена и при физиологических условиях составляла не более от первоначальной. Кроме того, была нарушена термодинамическая стабильность каталитически активной конформации. В целом, довольно сложно прогнозировать терапевтический эффект этого производного, а исследование биологического действия ЕсА 8 так и не было проведено. Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с щизкой глутаминазной активностью, и был реализован в данной работе. Цель данного исследования состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспарагиназы i i и характеристике ее терапевтически значимых свойств. Клонирование и экспрессия гена НрА в клетках . Получение рекомбинантного штаммапродуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию НрА. Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата НрА, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода получения фермента. Характеристика терапевтически значимых физикохимических и каталитических свойств НрА. Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам лейкозов человека. Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы ЕсА. Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характеристике новой бактериальной аспарагиназы. Впервые клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма i i, получен рекомбинантный штамм . НрА. Разработаны оптимальные условия экспрессии, разработан простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат НрА. Проведена детальная характеристика физикохимических и каталитических свойств НрА. Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов НрА аспарагина и глугамина. Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0, от аспарагиназной активности. Установлено, что НрА обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клегок острого лимфобластного лейкоза 4, лимфомы Беркитта i, а также хронического миелоидного лейкоза К2. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апопотоза. Установлено, что НрА иммунохимически отлична от аспарагиназы . Практическая ценность результатов данной работы главным образом состоит в их применении для разработки нового противолейкозного препарата. Острый лимфобластный лейкоз является самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии. На его долю приходится более всех опухолей у детей Павлова М. П., . Ежегодно в России регистрируют до новых случаев этого заболевания Кривошеина Е.