Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител

• Автор: Смирнова, Мария Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

1 История создания бифункциональных антител и области

их применения

2 Тестирование бифункциональных антител

3 Взаимодействие антител с антигенами в растворе и на

твердой фазе

4 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных

моноклональных антител

5 Применение бифункциональных антител в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном иммуноферментном методе

6 Заключение

III МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Клеточные линии

2 Очистка моноклональных антител с помощью
ионообменной хроматографии
3 Определение антипероксидазной активности антител
4 Определение антигенсвязывающей активности антител
5 Определение активности бифункциональных антител
иммуноферментным методом с двумя антигенами i I
6 Сэндвичметод тестирования миоглобина
7 Приготовление аффинных носителей
8 Аффинная очистка моноспецифических антител
9 Аффинная очистка бифункциональных антител
Определение концентрации белка
Приготовление антигенов и антител, меченых I
Определение концентрации меченых антител после
аффинной очистки
Анализ связывания меченых ,1 антител с антигеном,
адсорбированным на твердой фазе 3
Определение равновесной константы ассоциации при
связывании антител с иммобилизованными антигенами
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия
IV РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1 Очистка монофункциональных и бифункциональных
антител
1.1 Очистка моноклональных антител с помощью
ионообменной хроматографии
1.2 Очистка бифункциональных моноклональных антител с
помощью аффинной хроматографии 4
1.
2.1.
2.1.
Оценка чистоты полученных антител
1.4. Оценка антигенсвязывающей активности антител
Антигенсвязывающие свойства антител при связывании с антигенами, сорбированными на твердой фазе
2.1. Анализ характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном радиоиммунологическим
методом
Получение антител, меченых
Анализ взаимодействия меченых ,1 антител с иммобилизованным антигеном методом Скэтчарда
Анализ взаимодействия бифункциональных антител со специфичностью антимиоглобинантипероксидаза с иммобилизованным миоглобином
Модель бивалентного связывания бифункциональных антител при одновременной сорбции на твердую фазу смеси двух антигенов
Эффективность бифункциональных антител, как
детектирующих антител в твердофазном ИФА
ОБСУЖДЕНИЕ
Связывание антител с иммобилизованным антигеном
Эффективность бифункциональных антител, как
детектирующих антител в твердофазном иммуноферментном методе
ПРИЛОЖЕНИЕ
Теория связывания антител с антигеном
Анализ равновесного связывания антител с антигеном в
растворе у у
Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе у
3 Использование бивалентной модели для предсказания
теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации Ка5 в зависимости
от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
4 Использование бивалентной модели для предсказания
теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
5 Определение соотношения антител, связанных с
иммобилизованным антигеном бивалентно и моновалентно
VII ВЫВОДЫ
VIII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ антиген
АнтиМб моноклональные антитела к миоглобину человека
АнтиПХ моноклональные антитела к пероксидазе хрена
АнтиМбПХ бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена
АнтийО моноклональные антитела к человека
АнтийОПХ бифункциональные моноклональные антитела, несущие сайты связывания с человека и пероксидазой хрена
АТ антитела
БИАТ бифункциональные биспецифические моноклональные антитела
ИФА иммуноферментный анализ
Мб миоглобин
МКА моноклональные антитела
ПХ пероксидаза хрена
РИА радиоиммунологический анализ йв иммуноглобулин в человека.
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


РИА радиоиммунологический анализ йв иммуноглобулин в человека. Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами МКА гибридомная технология позволяет получать биспецифические бифункциональные антитела1 БИАТ, несущие сайты связывания двух различных антигенов АГ ii , . БИАТ синтезируются гибридными гибридомами тетрадомами, которые образуются при слиянии двух родительских гибридом Рис. Молекулы бифункциональных антител образуются в тетрадомах при рекомбинации двух АГсвязывающих сайтов полумолекул. Родительские МКА и соответствующий АГсвязывающий сайт БИАТ имеют одинаковую структуру АГсвязывающих центров см. Рис. АГсвязывающие свойства. В работе Алларда с соавторами . АГсвязывающсго сайта БИАТ. В практическом плане БИАТ, несущие сайты связывания с тестируемым антигеном и ферментом, например пероксидазой хрена
ПХ могут выполнять роль меченых молекул и заменять традиционные конъюгаты антитела, ковалентно связанные с ферментом. Такие БИАТ могут успешно использоваться в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе ИФА, и их называют биоконъюгатами нового поколения см. БИАТ могут быть также получены химически путем ковалентного связывания АГсвязывающих сайтов ГаЬфрагментов к двум неидеитичным антигенам. Однако такие антитела в настоящем исследовании не рассматриваются. Здесь и ниже термин меченые антитела употребляется нами в широком смысле и может предполагать любой характер маркирования метка изотопом, ферментом, коллоидом и т.