Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования

• Автор: Кабилов, Марсель Расимович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 116 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК обзор литературы

1.1. Детекция известных мутаций

1.1.1. Рестрикционный анализ

1.1.2. Аллель специфичная гибридизация

1.1.3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотидДНК

1.1.3.1. Химическая реакция

1.1.3.2. ДНКзимы

1.1.3.3. Р1арэндонуклеазы

1.1.3.4. Методы лигирования
1.1.3.5. Методы, основанные на использовании ДНКполимераз
1.2 Детекция новых мутаций
1.2.1. Конформационный анализ
1.2.1.1. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК
1.2 Полиморфизм длин фрагментов при действии
эндонуклеазой С1еауаве 1
1.2.2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК
1.2.2.1 Физикохимические методы
1.2.2.2. Методы химического расщепления гетеродуплексов
1.2.2.3. Методы детекции, основанные на использование мисматч
узнающих белков
1.3 Методы секвенирования
1.3.1. Секвенирование при синтезе
1.3.1.1. Секвенирование по Сэнгеру
1.3.1.2. Секвенирование при полимеризации
1.3.2. Секвенирование при расщеплении
1.3.2.1. Химическое расщепление
1.3.2.2. Экзонуклеазное расщепление
1.4. Заключение
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Исходные материалы
2.1.1. Реактивы и препараты
2.1.2. Буферы и растворы
2.1.3. Праймеры
2.2. Основные методы
2.2.1 Синтез и выделение олигонуклеотидов
2.2.2. Получение и выделение ПЦРфрагментов
2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов
2.2.4. УФиммобилизация и колориметрическое выявление на капроне
2.2.5 Исследование термической денатурации
2.2.6. Расчет термодинамических параметров комплексообразования
3. ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ДНК МЕТОДОМ ЛИГИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ СЕЛЕКТИВНОСТЬ ЭТАПОВ ГИБРИДИЗАЦИИ И ЛИГИРОВАНИЯ результаты и обсуждение
3.1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций
3.1.1. Концепция метода
3.1.2. Оптимизация условий анализа
3.1.2.1. Подбор концентрационных условий
3.1.2.2. Влияние дозы УФоблучения на эффективность
выявления ДНК
3.1.2.3. Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов
на различных ДНКматрицах
3.1.2.4. Влияние длины ПЦРфрагмента на эффективность
его колориметрического выявления
3.1.3. Колориметрическое выявление точечных мутаций
3.1.3.1. Детекция тринукпеотидной делеции и вставки
модель СРТЯ
3.1.3.2. Детекция однонуклеотидных замен модель ВИЧ1
3.2.Селектнвность гибридизации
3.2.1. Описание модели
3.2.2. Анализ функции селективности
3.2.3. Изменение селективности при варьировании концентрации зонда
3.2.4. Изменение селективности при варьировании структуры зонда
3.2.5. Изменение селективности при выявлении различных мисматчей
3.2.6. Анализ полученных результатов
3Л. Селективность лигирования
3.3.1. Дизайн модельной системы
3.3.2. Термическая стабильность модельных дуплексов
3.3.3. Лигирование комплементарных комплексов
3.3.4. Дискриминация одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного
разрыва
3.4. Программа для выбора максимально селективных зондов
ВЫВОДЫ ЮЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Тем не менее формальное определение селективности гибридизации как количественного параметра до сих пор не нашло широкого применения. Целью данной работы являлось систематическое исследование селективности метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов и разработка на основе метода нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК. Большинство методов выявления точечных мутаций включают несколько этапов амплификацию, селективное получение специфического продукта и его детекцию. Первый этап это амплификация исходного нуклеотидного материала геномной ДНК или РНК, количества которого, как правило, не хватает для анализа изза недостаточной чувствительности большинства методов. На втором этапе проводят селективную реакцию, продукт которой позволяет судить о том содержит ли последовательность точечную мутацию или нет. И последний этап это детекция специфического сигнала от продукта, полученного в результате селективной реакции, при его отделении, если необходимо, от исходной метки. Следует отметить, что возможны как совмещения некоторых этапов, например амплификации и селективной реакции, так и отсутствиенекоторых из них, кроме второго этапа, который присутствует во всех случаях. Данный обзор посвящен рассмотрению принципов, используемых в различных методах выявления точечных мутаций в НК, на основе которых происходит образование специфического продукта, свидетельствующего о наличии или наоборот отсутствии замены. Под селективностью понимается способность различения схожих нуклеотидных последовательности, отличающихся друг от друга точечной мутацией. Селективная реакция может иметь совершенно разную природу, например, физикохимическую, ферментативную или химическую, при этом может происходить изменение массы, конформации, флуоресценции и т. Представленные в этой части литературного обзора методы применяются в случае, когда известна первичная последовательность анализируемого сайта, тип и локализация выявляемой точечной мутации. Открытие рестриктаз позволило применить эти секвинсспецифичные эндонуклеазы для детекции точечных мутаций в ДНК. В случае, если мутация приводит к появлению или исчезновению определенного сайта рестрикции, обработка анализируемого ДНКфрагмента рестриктазой и разделение получившихся продуктов специфического расщепления гельэлектрофорезом позволяет судить о наличии или отсутствии мутации . Решением этой проблемы стал подход, в котором такой сайт создатся искусственно i ii i ПЦРопосредованный сайт направленный мутагенез Рис. Для этого при амплификации ДНК используют праймер, который располагается в непосредственной близости от сайта мутации и в районе 3конца содержит нуклеотид, некомплементарный ни нормальной, ни мутантной ДНК. В том случае, если исходная ДНК содержит мутацию, в результате ПЦР образуется фрагмент, содержащий сайт рестрикции , . Рестриктаза обычно подбирается так, чтобы сайт рестрикции содержал мутацию т. В случае нормальной ДНК сайт рестрикции не образуется и расщепление соответствующей рестриктазой не происходит. Гибридизация ДНК РНК с радиоактивно меченными протяженными зондами сотни нуклеотидов стала активно использоваться с разработкой методов и блотгибридизации ,. Разделенные в геле электрофорезом фрагменты НК переносят на мембрану капрон, нитроцеллюлоза и после их иммобилизации УФсвет, вакуум проводят инкубацию в денатурирующих условиях с протяженным зондом, полученным путем клонирования или ПЦР. Данный метод используется для детекции определенных нуклеотидных последовательностей. Применение синтетических о лигонуклеотидных зондов нт. ДНКзонд. Подбор условий, при которых бы происходило образование полностью комплементарного комплекса, а образование комплекса, содержащего мисматч, протекало бы на низком уровне, является непростой задачей. Гибридизацию зонда с ДНКмишенью проводят либо в растворе, либо на твердой фазе. Гибридизация в растворе протекает с большей скоростью, но при этом возникает необходимость отделения гибридизационного комплекса от несвязавшегося зонда, несущего метку для детекции.