Регуляция и экспрессия изоцитратлиазы у Gallus Domesticus в ходе эмбриогенеза и у крыс при экспериментальном диабете

• Автор: Зийат М. Вадах
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 152 с. : ил.

• Гла ва 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие аспекты патогенеза сахарного диабета
1.1.1. Особенности протекания биохимических процессов при аллоксановом диабете
1.2. Физиолого-биохимические особенности печени
1.3. Общая схема трансформации основных запасающих веществ в животном организме
1.4. Биохимические аспекты процессов, ведущих к интенсификации глюконеогенсза
® 1.4.1. Трансформация липидов в гликоген у высших животных
1.4.2. Ультраструктурные изменения клеток животных при патологических процессах
1.4.3. Роль глюконеогенетических ферментов и интермедиатов в эмбриогенезе и при экспериментальном диабете
1.5. Роль глиоксилатного цикла в трансформации жиров в углеводы у организмов разных таксонов
1.5.1. Глиоксилатный цикл - определяющий этап глюконеогенеза
1.5.2. Распространение глиоксилатного цикла
ф 1.5.2.1. Функционирование глиоксилатного цикла у микроорганизмов
1.5.2.1.1. Экспрессия маркерных ферментов глиоксилатного цикла у патогенных микроорганизмов
1.5.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла у растений и грибов
1.5.2.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных
1.5.3. Характеристика маркерных ферментов глиоксилатного цикла
1.5.3.1. Структура гена и белка изоцитратлиазы
1.5.3.2. Структура гена и белка малатсинтазы

1.5.4. Физико-химические характеристики изоцитратлиазы
1.5.5. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы
1.5.6. Регуляция экспрессионной активности ключевых ферментов глиоксилатного цикла
1.5.7. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Цель и задачи
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Создание модели аллоксанового диабета у крыс Rattus Rattus L
2.2.2.2. Выращивание эмбрионов птиц Gallus domesticus L
2.2.2.3. Получение экстрактов различных тканей
2.2.2.4. Дифференциальное центрифугирование
2.2.2.5. Определение активности ферментов
2.2.2.6. Определение концентрации метаболитов углеводного обмена
2.2.2.1. Определение количества белка
2.2.2.8. Выделение и очистка ферментов
2.2.2.9. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
2.2.2.10. Гель-фильтрация и ионообменная хроматография
2.2.2.11. Определение молекулярной массы фермента
2.2.2.12. Электрофоретические исследования белков
2.2.2.13. Определение массы субъединиц фермента
2.2.2.14. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.2.2.15. Экстракция суммарной РНК
2.2.2.16. Проведение обратной транскрипции мРНК и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
2.2.2.17. Определение количества РНК и ДНК
2.2.2.18. Анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей
2.2.2.19. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.2.2.20. Статистическая обработка данных
2.3. Полученные результаты и их обсуждение
2.3.1. Разработка модели экспериментального диабета
2.3.2. Динамика содержания основных субстратов и метаболитов в печени крыс при экспериментальном диабете и в печени эмбрионов птиц
2.3.3. Динамика активности ферментов основных метаболических путей в печени крыс с экспериментальным диабетом и в печени эмбрионов птиц
2.3.3.1. Индукция ферментов глиоксилатного цикла у крыс при экспериментальном диабете и у птиц в ходе онтогенеза
2.3.4. Изучение субклеточной локализации глиоксилатного цикла в животных тканях
2.3.5. Очистка изоцитратлиазы из печени крыс с аллоксановым диабетом и изучение ее свойств
2.3.6. Очистка и изучение свойств изоцитратлиазы из печени эмбрионов птиц
2.3.7. Сравнение свойств ИЦЛ из печени крыс и эмбрионов птиц
2.4. Характеристика экспрессии ИЦЛ в печени эмбрионов птиц и в печени крыс, страдающих аллоксановым диабетотм
2.4.1. Разработка праймеров для идентификации гена изоцитратлиазы в геномах животных различных таксономических групп
2.4.2. Проведение ПЦР для обнаружения гена ИЦЛ в геномах животных.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

Единственный ген MC (GlcB) у возбудителя туберкулёза кодирует белок с молекулярной массой 80 кДа, что соответствует 741 аминокислотному остатку (Heidelberg et al., 2000). Белок MC M.tuberculosis является гомотетрамером, и каждая субъединица состоит из а и ß областей (рис.35). 1-й домен из 8а и 8ß структур, собранных в TIM баррель, который, в свою очередь, состоит из 115-134 и 266-557 остатков аминокислот. 2-й домен на С-конце (остатки аминокислот 591-727) представлен главным образом спиралью. 3-й домен располагается между al и ß2 структурами TIM барреля (остатки 135-265). Полная структура гена M.tuberculosis очень схожа с таковой E. coli, который был описан в комплексе с глиоксилатом и Mg2+ (Howard et al., 2000). У этих двух белков отмечают большую степень гомологии в 71 % (Holm et al., 1993). База данных пространственной организации MC в настоящее время включает 24 надсемейства TIM - барреля. Однако, TIM - баррель MC помещён в собственное надсемейство, называемое МС-G (Lo Conte et al., 2000; Lo Conte et al., 2002).
В последние годы уделяется большое внимание изучению генетических механизмов регуляции активности MC. Гены, кодирующие ферменты глиоксилатного цикла, имеются, вероятно, у всех организмов, но экспрессируются не во всех тканях и не на всех стадиях онтогенеза. Благодаря этим исследованиям довольно подробно изучена структура генов кодирующих MC в различных организмах. Так, например, из ДНК огурца {Cucumber sativa) и тыквы были выделены гены MC, определена их полная нуклеотидная последовательность и структура активаторов транскрипции. Также проведен полный сиквенс генов MC у Е. coli, Streptomyces claviligerus NRPL3585, Bradyrhizobium japonicum, Corynebacterium glutamicum, Streptomyces arertae, S. cerevisiae, Candida tropicalis, Aspergillus nidulans и Neurospora crassa, Hansenulla polymorpha.
Американские исследователи подобрали праймеры на малатсинтазу и методом ПЦР получили продукт из 45 видов пальм (Arecaceae) (Lewis et al., 2001). Было показано, что в геноме Arecaceae ген MC представлен единственной копией с экзонными областями, являющимися филогенетически информативными в пределах данного семейства. Используя клонированный экзонный участок гена MC размером 428 н.п. была построена филогенетическая лестница для 45 видов пальм.
1.5.4. Физико-химические характеристики изоцитратлиазы.
Выделение и очистка ИЦЛ. К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, грибов (Masaaki et