Выявление структурных особенностей лизиновой тРНК, определяющих ее селективный импорт в митохондрии дрожжей

• Автор: Казакова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

1.1. Импорт нуклеиновых кислот в митохондрии

1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших

1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии растений

1.1.3. Импорт РНК в митохондрии млекопитающих

1.1.4. Импорт тРНК I митохондрии vii

1.2. Механизм импорта РНК в митохондрии

1.2.1 Участие мембранных факторов в импор те тРНК

1.2.2. Участие цитоплазматических факторов в импорте тРНК

1.2.2.1. Взаимодействие тРНК с аминоацилтРКсинтетазами

1.2.2.2. Участие аминоацилтРНКсинтетаз в импорте тРНК

1.2.3. Структурные элементы тРНК, определяющие селективность импорта

1.2.4. Механизм переноса тРНК через митохондриальные мембраны
1.3. X. Использование метода для выявлении нуклеотидов, определяющих специфичность взаимодействия с белковыми факторами
1.3.1. Основные принципы метода X
1.3.2. Поиск элементов в структуре тРНК, определяющих избирательные взаимодействия с АРСазами, с использованием метода X
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Штаммы микроорганизмов
2.2. Генноинженерные методы
2.2.1. Исходные генноинженерные конструкции
2.2.2. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез
3 Оглавление
2.2.3. Выращивание у раци лсодержащих фагов
2.2.4. Выделение однонитевой ДНК из фаговых частиц
2.2.5.Определение нуклеотидной последовательности рекомбинантных плазмид
2.2.6. Выделение и очистка рекомбинантных плазмид
2.3. Т7транскрипция
2.3.1. Использование ПЦР для создания ДНКматриц для
Т7транскрипции
2.3.2. Реакция Т7транскрипции я vi
2.4. Электрофорез нуклеиновых кислот в II и в агарозном геле
2.5. Радиоактивное мечение транскриптов
2.6. Транспорт радиоактивно меченных транскриптов гена тРНК
н тРНК2 в изолированные митохондрии
2.7. Лминоацилирование транскриптов
2.8. Связывание транскриптов с
2.9. Импорт гибридных молекул тРНК2 в митохондрии дрожжей ш viv
2.9.1. Трансформация клеток . vii
2.9.2. Выделение клеточной тРИК . vii
2.9.3. Выделение митохондрий из клет ок . vii
2.9.4. Выделение митохондриальной тРНК
2.9.5. Гибридизация с олигонуклеотидными зондами
2 Метод X
. Создание вырожденной библиотеки для проведения X
. Условия проведения связывания с и импорт в митохондрии
. Обратная транскрипция и амплификация
. Клонирование и секвенирование
. Математические методы и программы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Элементы, определяющие селективность импорта в амниоакцепторном стебле лизиновой i РНК
3.1.1. Изучение гибридных молекул тРНК и тРНК2 i vi
Оглавление
3.1.2. Импорт мутантных тРНК i viv
3.1.3. Роль оснований аминоакцепторного стебля в митохондриальном импорте тРНК
3.2. Поиск нуклеотидных последовательностей в молекуле лизнновой тРНК, способствующих избирательному импорту в митохондрии, с использованием метода X
3.2.1. Характеристика библиотек РНК, отобранных в ходе селекции по способности к импорту в изолированные митохондрии
3.2.2. Характеристика библиотек РНК, отобранных по способности связываться с
3.2.3. Анализ полученных в ходе селекции последовательностей
3.2.4. Анализ индивидуальных вариантов
3.2.5. Обсуждение результатов селекции
4. ВЫВОДЫ
5. ПРИЛОЖЕНИЯ
СI I СО К Л ИТЕР АТУ РЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ АТР Аденозинтрифосфорная кислота
АРС АминоацилтРНКсинтетаза
Бычий сывороточный альбумин
ДЭГ1К Диэтилпирокарбонат
ДТТОТТ Дитиотриэтол
ЭДТАЕ0ТА эти лсндиам иигстрау ксусная кислота
ЮР i ii iпфракция цитоплазматических
белков, необходимых для импорта i vi кДа килодальтон
Константа связывания
Км Константа Михаэлиса
Цитоплазматическая лизилтРНКсинтетаза
I внутренняя митохондриальная мембрана
митохондриальная сайтспецифическая
эндорибонуклеаза митохондриальная лизилтРНКсинтетаза
ОМ внешняя митохондриальная мембрана
Пре предшественник
ПААГ Полиакриламидный гель
ПСА Персульфат аммония
Пре Предшественник
Г1ЦР олимерашоцепная реакция
Обратная транскрипция и амплификация
i iii iбелок кДа,
участвующий в импорте тРНК в митохондрии . i
Грис 1 идроскиметиламинометан
ТХУ Три хлору ксусная кислота
1 цитоплазматическая тР1 I дрожжей
i 1К2 цитоплазматическая тР1 I иии Дрожжей
тРН КЗ митохондриальная дрожжей
транскрипт
т.н.п. тысяча пар нуклеотидов
н Нуклеотид
пуриновые нуклеотиды
Ру пиримидиновые нуклеотиды
ААстебель аминоакцепторный стебель тРНК
ветвь антикодоновая ветвь тРНК
ветвь дигидроуридиловая ветвь тРНК
Тветвь риботимидиловая ветвь тРНК
Vветвь вариабельная петля тРНК
V 5метиламинометил2тиоуридин
5 5карбоксиметилуридин
Введение


Изучение другого отряда простейших ii ii и i показало, что в последовательности митохондриальной ДНК генов тРНК нет, следовательно, все тРНК митохондрий этих организмов импортируются из цитоплазмы i, . Ядерные гены тРНК были клонированы, а затем использованы в качестве зондов. Митохондриальные и цитоплазматические тРНК гибридизовались с зондами, а митохондриальные ДИК нет а. Несколько групп исследователей, изучающих импорт тРНК в митохондрии простейших, предлагают разные гипотезы транспорта тРНК. Согласно данным одной группы авторов, тРНК транспортируется в митохондрии трипаносоматид в виде предшественника с дополнительным участком на 5конце. В митохондриях тРНК подвергаются процессингу при участии нуклеотидилтрансферазы и РНКазыР, которая отщепляет 5конец . Было показано также, что и Т. Полноразмерные зрелые тРНК имели низкую эффективность импорта в изолированные митохондрии, в то время как предшественники импортировались с высокой эффективностью. Процесс импорта является АТФзависимым, требует наличия мембранного потенциала, и в нем принимают участие белки, ассоциированные с поверхностью митохондриальной мембраны v , . После импорта предшественника в митохондрии происходит модификация тРНК, в результате которой цитозин в положении С в митохондриальных тРНК превращается в метилцитозин. Такая же модификация есть у митохондриальной популяции и тРНКТуг. Однако ряд данных других групп исследователей указывают, что окружение генов импортируемых тРНК не оказывает влияние на селективность их импорта в митохондрии. Показано, что предшественник тРНК, описанный в статье . РНК iv . Также изучение последовательностей рядом с генами импортируемых тРНК ii показало, что нет четкой зависимости эффективности импорта тРНК в митохондрии от состава и размера фланкирующих последовательностей , а также от расположения этих генов i . Изучение импорта тирозиновой тРНК в митохондрии . РНКГуг требуется процессинг, т. РНК есть интрон. Тем не менее, вставка двух нуклеотидов в область экзона и двух нуклеотидов в область интрона, которая полностью блокировала сплайсинг тРНК и предотвращала ее аминоацилирование, не препятствовала импорту в митохондрии i . Ь. Подобная работа была проведена также по импорту тРНКТут . Тирозиновая тРНК лейшманий содержит широк размером и. Рис. Ангикодоноваи петля тирозиновой тРНК , содержащая к. Нуклеотиды ан ти кол о н а заключены в рамку по i . Введение чужеродных последовательностей в эту часть молекулы не препятствовало импорту тРНК в митохондрии. Однако размер вставки не мог превышагь и. Также эти эксперименты показали, что антикодоновая часть молекулы не является основным элементом, определяющим импорт в органеллу. Изучение импорта тирозиновой тРНК . РНК дрожжей и цитоплазматической лизиновой тРНК человека в митохондрии тринаносоматид i viv показало возможность импорта чужеродных тРНК. Следовательно, элементы, определяющие селективность импорта, не присутствуют в геномном окружении i, . РНК с антикодоном . В митохондриях также была обнаружена глутаминовая аминоацилтРНКсинтетаза . Этот факт оказался довольно неожиданным, т. РИК в митохондриях аминоацилируется при помощи глутаматной синтетазы, а затем амидотрансфераза превращает в i . Авторы полагают, что нет прямой связи между процессами импорта и амииоацилировапия тРНК митохондриальной синтетазой . Эта группа исследователей также полагает, что для импорта тРНК необходим АТФ, но не требуется мембранный потенциал, и тРНК импортируются иным путем, чем митохондриальные белки . Группа исследователей, изучающая импорт тРНК в митохондрии . II . На определенном этапе развития этих организмов происходит быстрое увеличение скорости синтеза тубулина. Синтез белка регулируется на посттранскрипционном уровне. Используя синтетическую антисмысловую РНКпробу из 5нетранслируемой части г ена тубулина, было показано, что РНК образует комплекс с белками. Эти белки также связывались с тРНК. Результаты делеционного анализа антисмысловой тРНК показали, что за связывание отвечает пуринбогатый участок . Антисмысловая РНК 5нетранслируемой части гена тубулина эффективно импортировалась в изолированные митохондрии ii. Для эффективного импорта требовалось наличие АТФ.