Выделение и характеристика противоопухолевых белков их лимфоцитов и тромбоцитов человека

• Автор: Паромов, Виктор Максимович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Тромбоциты как эффекторы иммунной системы.

1.1. Морфология и функциональные особенности тромбоцитов.

1.1.1. Морфология тромбоцитов.

1.1.2. Основные механизмы активации тромбоцитов.

1.2. Противоопухолевые свойства тромбоцитов.

1.2.1. Цитотоксическая активность тромбоцитов.

1.2.2. Взаимодействие тромбоцитов и опухоли.

1.3. Цитокины тромбоцитов.

1.3.1. Тромбоциты и цитокины. продукция и отклик

1.4. Основные механизмы клеточной гибели.

1.4.1. Некроз.
1.4.2. Апоптоз
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Реактивы, буферы и растворы
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Культивирование и стимуляция тромбоцитов человека
2.2.2. Получение лизатов стшчулированных тромбоцитов человека.
2.2.3. Получение супернатантов стимулированных тромбоцитов человека.
2.2.4. Культивирование и стимуляция мононуклеаров периферической крови человека.
2.2.5. Получение супернатантов стимулированных мононуклеаров периферической крови человека.
2.2.6. Функциональные исследования тромбоцитов.
2.2.7. Фракционирование белков по молекулярным массам с помощью центрифугирования с использованием мембран М1сгосоп
2.2.8. Высокоэффективная жидкостная хроматография белков.
2.2.9. ДСНэлектрофорез белков и электроблоттинг на РТР мембрану.
2.2 Сканирование белков иммобилизованных на РТР мембране.
2.2 Определение аминокислотной последовательности белков
иммобилизованных на РУГР мембране.
2.2 Элюция белков с РУОТ мембраны
2.3 Цитотоксический тест с использованием витального красителя МТТ.
2.3 Исследование пролиферации клеток по включению Нгимидина.
2.3 Статистическая обработка результатов.
2.3 Получение поликлональных антител к цитотоксическим белкам тромбоцитов.
2.3 Иммуноблоттинг.
2.3 Определение нуклеосомальной фрагментации клетокмишеней
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Исследования стимулированных тромбоцитов человека.
3 .1.1. Цитотоксичсская активность тромбоцитов человека, стимулированных
различными экзогенными агентами
3.1.2. Функциональные исследования тромбоцитов, стимулированных различными экзогенными агентами.
3.1.3. Сравнительная цитотоксичность тромбоцитов и мононуклеаров периферической крови человека, стимулированных Саионофором.
3.2. Выделение и характеристика цитотоксических белков из экстракта тромбоцитов человека стимулированных Саионофором.
3.2.1. Выделение и структурные исследования цитотоксических белков ЦТФ
и ЦТФ из лизата тромбоцитов человека, стимулированных Саионофором.
3 .2.2. Исследования цитотоксичности белков ЦТФ и ЦТФ.
3.2.3. Изучение механизма гибели клетокмишеней, индуцируемого белками
ЦТФ и ЦТФ.
3.2.4. Идентификация белков ЦТФ и ЦТФ в супернатантах и лизатах тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами.
3.3. Выделение и характеристика белка массой кДа, повышающего пролиферативный ответ мононуклеаров периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А, из супернатанта тромбоцитов человека стимулированных Саионофором.
3.3.1. Выделение и структурные исследования белка массой кДа из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Саионофором
3.3.2. Исследования биологической активности белка массой кДа из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Саионофором.
3.3.3. Идентификация белка массой кДа в супернатанте мононуклеаров
периферической крови человека, стимулированных Саионофором.
Список литературы.
Список сокращений
АДФ аденозиндифосфат АМФ адснозинмонофосфат АТФ аденозинтрифосфат АЦ аденилатциклаза
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ГКГ главный комплекс гистосовместимости
ГТФ аденозинтрифосфат
ДГ 1,2диацилглицерол
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН додецил сульфат натрия
ИЛ интерлейкин
Кон А конканавалин А
МНК мононуклеарные клетки
МТТ ,5диметилтриазол2ил2,5дифенил2Нтстразолиум бромид
НК натуральные киллеры
ПААГ полиакриламидный гель
ПКС протеинкиназа С
РНК рибонуклеиновая кислота
ТФУ трифторуксусная кислота
УТФ урацилтрифосфат
ФАТ фактор активации тромбоцитов
ФГА фитогемагглютинин
ФЛА фосфолипаза А
ФЛС фосфолипаза С
ЦТЛ цитотоксические Тлимфоциты
ЦТФ цитотоксический тромбоцитарный фактор
аденокарцинома легкого
кластер дифференцировки
эндотелиальный расслабляющий фактор
гранулоцитколоний стимулирующий фактор
гранулоцитмакрофагколоний стимулирующий фактор
1Р3 инозитол 1,4,5трифосфат
тромбоцитарный эпидермальноклеточный ростовой фактор
тромбоцитарный ростовой фактор
2 простагландин
2 простагландин
2 простагландин
I2 простагландин I
I2 фосфатидидилинозитол 4,5дифосфат
V поливинилидендифлуорид
ТХАг тромбоксан А
ТХВ2 тромбоксан В
трансформирующий ростовой фактор
фактор некроза опухоли
Введение
Актуальность


Цитотоксический тест с использованием витального красителя МТТ. Исследование пролиферации клеток по включению Нгимидина. Статистическая обработка результатов. Получение поликлональных антител к цитотоксическим белкам тромбоцитов. Иммуноблоттинг. Глава 3. Результаты и обсуждение. Исследования стимулированных тромбоцитов человека. Функциональные исследования тромбоцитов, стимулированных различными экзогенными агентами. Сравнительная цитотоксичность тромбоцитов и мононуклеаров периферической крови человека, стимулированных Саионофором. Выделение и характеристика цитотоксических белков из экстракта тромбоцитов человека стимулированных Саионофором. ЦТФ из лизата тромбоцитов человека, стимулированных Саионофором. Исследования цитотоксичности белков ЦТФ и ЦТФ. ЦТФ и ЦТФ. Идентификация белков ЦТФ и ЦТФ в супернатантах и лизатах тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами. Выделение и характеристика белка массой кДа, повышающего пролиферативный ответ мононуклеаров периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А, из супернатанта тромбоцитов человека стимулированных Саионофором. Исследования биологической активности белка массой кДа из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Саионофором. Саионофором. Список литературы. Актуальность проблемы. Важную роль в осуществлении именного ответа организма играют цитокины белковые факторы, продуцируемые в основном лимфоцитами и другими клетками иммунной системы. Цитокины составляют особый класс секреторных белков, которые действуют через рецспторопосредованные пути и регулируют различные межклеточные взаимодействия, вызывая гуморальный ответ как иммунных, так и тканевых клеток организма. Цитокины, таким образом, вызывают широчайший спекгр клеточных ответов активацию, пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов и других клеток крови, направленную миграцию клетокэффекторов, активизацию процессов программируемой клеточной гибели и т. Изучение как самих цитокинов, так и всего многообразия опосредованных ими клеточных ответов имеет традиционно важное значение для развития новейших методов иммунотерапии онкологических заболеваний. Основное внимание при изучении клеточных механизмов противоопухолевого иммунитета традиционно уделяется лимфоцитам в особенности Тклеткам как важнейшим клеткамэффекторам иммунной системы, а также, немного в меньшей степени, макрофагам, гранулоцитам и моноцитам. Однако, последние исследования в данной области показали, что наряду с лимфоцитами и другими иммунными клетками важную роль в проведении сигналов и осуществлении как противовоспалительных, так и противоопухолевых функций играют клетки крови, основные задачи которых напрямую не связаны с модуляцией иммунных ответов организма. Наряду с этими функциями тромбоциты, как было показано 1, играют заметную роль в процессах цитолиза различных опухолевых клеток. В ряде последних работ показано, что тромбоциты проявляют 1йО, опосредованную цитотоксичность как в отношении паразитических одноклеточных микроорганизмов 2,3, так и в отношении эндотелиальных клеток 4,5 и эритроцитов 6. Противоопухолевая цитогоксичность тромбоцитов может быть опосредована антителами и белками комплемента 7. В то же время, как активированные, так и неакгивированные тромбоциты способны эффективно лизировать различные линии опухолевых клеток в отсутствии специфических антител и белков комплемента 8,9. Таким образом, тромбоциты можно рассматривать в качестве полноценных эффекторных клеток иммунной системы. Хотя эти кровяные тельца довольно малы 0 сравнению с лимфоцитами или макрофагами и, кроме того, не обладают ядром, по общему количеству и общей площади поверхности клеточных мембран находящиеся в кровяном русле организма тромбоциты значительно превосходят как лимфоциты, так и любые другие классические клеткиэффекторы иммунной системы. Таким образом, роль тромбоцитов в активизации защитных процессов организма на клеточном уровне заслуживает пристального внимания. Стимуляция цитолитической активности тромбоцитов так или иначе связана с их активацией.