Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS

• Автор: Саттарова, Евгения Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Активные формы кислорода в организме

1.1.1. Перекись водорода

1.1.2. Супсроксндный анионрадикал

1.1.3. Синглетный кислород

1.1.4. Гидроксильный радикал

1.1.5. Оксид азота

1.2. Цитотоксическос действие ЛФК в организме.
1.2.1. Взаимодействие АФК с белками.
1.2.2. Перекисное окисление липидов.
1.2.3. Взаимодействие АФК с нуклеиновыми кислотами
1.2.3.1. Повреждении дсзоксирибозы.
1.2.3.2. Образование сшивок
1.2.3.3. Окисленные пуриновые основания
1.2.3.4. Окисленные пиримидиновые основания
1.2.4. Репарация окислительных повреждений ДНК
1.3. Антиокнслнтельная защита организма.
1.3.1. Механизмы антиокнслитсльной зашиты нсферментативной природы
1.3.2. Механизмы ферментативной антиокнелительной защиты
1.3.2.1. Супероксиддисмутаза.
1.3.2.2. Катачази
1.3 2.3. Псроксидаза.
1.3.2.4. Глутапгион зависимые ферменты.
1.4. Молекулярные маркеры окислительного стресса
1.5. Методы анализа повреждений в ДИК.
1.6. Роль окислительных повреждений в процессе старения и возникновении АФК зависимых заболеваний
1.7. Модели животных для изучения механизмов окислительного стресса.
2.1. Реактивы и материалы.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение и очистка геномной ДНК крыс
2.2.2. Определение концентрации ДНК.
2.2.3. Электрофоретический анализ препаратов ДНК
2.2.4. Получение контрольных препаратов ДНК.
2.2.5. Определение оптимальной концентрации гибридомной надклеточной жидкости, содержащей антитела к 8охоО дя нммуноферментного определения 8охоО в геномной ДНК
2.2.6. Определение оптимальной концентрации вторичных антител для иммуноферментного определения 8x в геномной ДИК
2.2.7. Определение концентрации ДНК для количественной иммобилизации в лунки планшетов
2.2.8. Определение 8x п геномной ДНК крыс линий X и i.
2.2.9. Им.мунофлуорссцснтиос определение 8x в клетках печени крыс.
2.2 Регистрация флуоресцентного сигнала и статистический анализ данных
по определению 8x в клетках печени крыс.
2.2 Получение контрольных препаратов срезов печени крыс.
2.2 Определение мутагенности новых синтетических производных на основе 2,бдимстилфенола.
2.2 Определение антиокнелительной активности исследуемых соединений.
2.2 Определение доминантных легальных мутаций в зародышевых клетках мышей.
2.2 Иммунофлуоресцентное определение 8x и 8оксогуанинДНК гликозилазы в различных клетках головного мозга крыс.
2.2 Регистрация флуоресцентного сигнала и статистический анализ данных по определению 8x в клет ках головного мозга крыс
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Оптимизация метода иммуносорбентного анализа1 для определения 8x в геномной ДНК.
3.2. Анализ содержания 8x в геномной ДНК крыс
3.3. Иммунофлуоресцентное определение 8x в срезах печени крыс.
3.4. Возрастная и межлиненная динамика уровня окислительных повреждений ДНК клеток печени крыс.
3.5. Определение уровня 8x и 1 в ядрах клеток головного мозга крыс линий X и i методом иммунофлуоресцентной микроскопии т i.
3.5.1. Оценка уровня 8x у крыс линий X и i в ядрах немаркированных клеток головного мозга
3.5.2. Оценка уровня 8x у крыс линий X и i в ядрах немаркированных клеток, и клеток, окрашенных маркерами дифференцировки нервных клеток
3.5.3. Оценка уровня белка 1 в ядрах немаркированных клеток головного мозга и клеток, окрашенных I и маркерами дифференцировки нервных клеток у крыс линий X и i
3.6. Синтез новых антиокислителей на основе 2,6диметил фенол а
3.7. Анализ мутагенности исследуемых соединений в тесте Эймса
3.8. Анализ антиокнелительной активности исследуемых соединений с помощью штаммов клеток Е. i, дефинитных по репарации окислительных повреждений в ДНК.
3.9. Определение доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей
3 Влияние исследуемых антиоксидантов на уровень 8x и 1 в клетках головного мозга крыс линий X и i
3 Статистический анализ внутри и межлинейной динамики уровня 8x и 1 в маркированных и немаркированных клетках головного мозга крыс линий X и i.
3 Сравнение иммуногистохимических маркеров в различных группах крыс.
3 Корреляция между иммуногистохимичсскими маркерами.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ОН, 0, 2, Ог, НОС1, НОВг и третичные, к которым относят радикалы антиоксидантов. Среди причин появления свободных радикалов также можно выделить три основных фактора радиация ОН, Н, , УФизлучснис , 2, Ог и действие ксенобиотиков радикалы токсинов. Такая классификация АФК оправдана с позиций их биологической значимости, и позволяет выявить главные молекулярные процессы генерации АФК при патологических процессах. Источниками II в живых организмах являются ферментативные реакции, катализируемые оксидазами, переносящими два электрона на молекулу кислорода, такимикак ксантиноксидаза, оксидазы Iаминокислот, а также реакция дисмутации, катализируемая супероксиддисмутазой СОД около Н2О2, генерируемой фагоцитами, в очаге воспаления, образуется в результате этой реакции превращение молекулы О2 в перекись водорода происходит под дейст вием уратоксидазы . Ещ одним источником Н2О2 является пероксисомальное 3окисление жирных кислот. Было показано, что молекулы перекиси водорода могут покидать пероксисомы и выходить в цитоплазму клетки . Перекись водорода является источником высоко реакционноспособиого гидроксильного радикала, а в присутствии миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и лактопероксидазы гипогалоидов НОС1, НОВг, I, . Механизмы цитотоксичсского действия Н2О2 довольно разнообразны. В миллимолярных концентрациях II обладает цитотоксическим действием и может вызывать гибель фибробластов и других типов клеток, включая, гспатоциты и эндотелиальные клетки. В сублетальных концентрациях пероксид водорода существенно изменяет статус эндотелиальных клеток, что проявляется, в ингибировании транспорта анионов через мембрану, увеличении внутриклеточной концентрации Са2, активации фосфолипаз и фосфоинозитидного обмена, повреждает ,, тем самым снижая антиоксидантную защиту клеток 1. При действии перекиси водорода наблюдается инактивация ферментативных антиоксидантов каталазы и глутатионпероксидазы , которые, в тоже время, обеспечивают устойчивость клеток к токсическому действию перекиси. Необходимо отметать, что в живых системах перекись водорода является важным физиологическим регулятором, участвуя в механизмах поддержания кровоснабжения миокарда при сниженном уровне 0, модулируя секреторную активность кишечника и др. Во всех аэробных клетках в процессе присоединения одного электрона к молекуле кислорода образуются супероксидный аиионрадикал 0 и его протонированная форма гндроперекисный радикал НОг . Химическая активность Ог в значительной степени зависит от физикохимического состояния окружающей его клеточной или внеклеточной среды. В водных растворах Ог способен окислять аскорбиновую кислоту, адреналин и тиоловые соединения, выступая как слабый окислитель . Сулсроксид анионрадикал не обладает непосредственной микробицидной активностью, а при воспалении служит пусковым звеном каскада реакций, приводящих к образованию других активных форм кислорода Н2О2, Ог, ОМОО, ОМ и НО . В живых системах СЬ является промежуточным продуктом многих биохимических реакций окисление тиолов, флавннои, хипонов, катехоламинов, метаболизма ксенобиотиков. Основные источники его образования эго ферментативные системы ЫАЭРНзависимые оксидазы и оксигеназы фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза, микросомальные моиооксигеназы 1, . Образуется О2 радикал в митохондриальной дыхательной цепи в ДЬцитохром с редуктазном комплексе, а также при самопроизвольном окислении гемоглобина, ферредоксинов, восстановленных цитохромом Ь5 гидрохинонов, тетрагидроитеридинов и адреналина. О2 является малоактивным радикалом и не влияет на функционирование большинства ферментов, хотя может инактивировать некоторые из НИХ. Чем больше В митохондриях , тем выше вероятность повреждения митохондриальной ДИК, расположенной в матриксе митохондрий рядом с местом образования супероксида в гребнях внутренней митохондриальной мембраны. Повреждение митохондриальной ДНК ведет к нарушению синтеза белков переносчиков электронов дыхательной цегш. Торможение дыхательной цепи, в свою очередь, ускоряет генерацию супероксида и т.