Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей

• Автор: Туаева, Наталья Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 154 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ФЕНОМЕН ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ПРОИСХОЖДЕНИЕ, СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

1.1.1. Причины появления вкДНК в кровотоке

1.1.2. Структурная организация и размеры молекул вкДНК плазмы крови в норме и при различных заболеваниях

1.1.3. Биологическая роль вкДНК в норме и при некоторых заболеваниях

1.1.4. Концентрация вкДНК в плазме крови в норме и при различных патологических состояниях

1.2. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК

1.2.1. ВкДНК как диагностический и прогностический критерий

1.2.2. Необходимость изучения вкДНК плазмы крови у новорожденных детей

1.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Объект исследования
2.3. Определение концентрации вкДНК плазмы крови
2.3.1. Получение плазмы крови
2.3.2. Выявление неспецифического взаимодействия 2 с белками плазмы крови
2.3.3. Депротеинизация и определение концентрации вкДНК в
плазме крови
2.4. Определение фракционного состава вкДНК
2.5. Определение параметров ядер лимфоцитов периферической крови новорожденных детей
2.6. Определение содержания гиподиплоидных клеток в популяции лимфоцитов периферической крови
2.7. Определение мобильных генетических элементов в составе вкДНК плазмы крови новорожденных детей
2.7.1. Выделение вкДНК из плазмы крови на иммобилизованном сорбенте оСобеБйх
2.7.2. Выделение ДНК из клеток крови
2.7.3. Постановка П,Р
2.7.4. Детекция продуктов амплификации
2.8. Постановка иммуноферментного анализа для определения АТ к нативной и денатурированной ДНК
2.9. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Концентрация вкДНК в плазме крови новорожденных детей
3.2. Оценка состояния популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных
3.3. Характеристика вкДНК
3.4. Взаимосвязь концентрации вкДНК и уровня содержания АТ к ДНК
у новорожденных
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому, чтобы приблизиться к пониманию роли вкДНК в организме человека, необходимо изучить структуру этой ДНК и выяснить, какие процессы ведут к появлению вкДНК в кровотоке и обеспечивают динамику ее количества в норме и при патологии. Активная экскреция экстрахромосолиюй ДНК лимфоцитами. Происхождение вкДНК является одним из важнейших аспектов в изучении внеклеточных нуклеиновых кислот, так как непосредственно определяет их структуру, а следовательно, и биологические эффекты. Происхождение вкДНК в кровотоке человека на сегодняшний день до конца не выяснено. По данным литературы, в организме существует несколько процессов, способных приводить к появлению вкДНК в плазме крови. Один из них активный процесс экскреции внехромосомных ДНК лимфоцитами. ДНК в ядрах клеток и активной экскреции ее во внеклеточную среду. Одними из первых, кто описал выход ДНК из лимфоцитов, была группа под руководством . Установлено, что подавляющее большинство ,9 лимфоцитов, циркулирующих в периферической крови у человека и животных, находятся в состоянии интерфазы и характеризуются очень низким уровнем спонтанного синтеза ДНК. Авторы культивировали лимфоциты на среде, содержащей Н тимидин, в присутствии таких митогенов, как фитогемагглютинин ФГА или конканавалин А конА, а так же в присутствии антигенов эпидемического паротита. На третьи сутки инкубации клеток претерпевали бласттрансформацию и синтезировали ДНК, включая в ее состав Н3тимидин. Когда лимфоциты тщательно отмыли от несвязавшегося тимидина и вновь прокультивировали на свежей среде в течение 3х дней, оказалось, что клетки потеряли от до вновь синтезированной Н3ДНК. Одновременно в культуральной среде появлялась меченая Н3ДНК, количество которой постепенно нарастало. Тогда как клеток оставалось жизнеспособными, количество внеклеточной Н3ДНК в случае с конА и антигеном паротита превышало уровень, который мог бы образоваться при гибели всех клеток культуры. Экскретируемая ДНК при этом находилась в комплексе с белками и липидами. Аналогичный процесс происходил и без стимуляции, но количество ДНК как в культуральной среде, так и в самих лимфоцитах было в 4 6 раз меньшим. Работавшая независимо группа . ДНК из лимфоцитов без стимулирующих агентов и показала, что концентрация экскретированной во внешнюю среду ДНК, повидимому, является постоянной величиной. ДНК. Если затем отмытые лимфоциты повторно помещали в ту же среду, больше ДИК не выделялось. Но если эти же лимфоциты помещали в свежую инкубационную среду, экскреция ДНК возобновлялась. Результаты двух восьмичасовых экспериментов показали, что при непрерывном культивировании в течение всего срока, количество экскретируемой ДНК достигало мкг в 0 мл среды. Если то же самое количество клеток инкубировалось с заменой инкубационной среды через каждые 2 часа, то суммарное количество ДНК, выделенное за те же 8 часов, составляло мкг в суммарных 0 мл среды. То есть, в последнем случае имела место более интенсивная экскреция ДНК. Молекулярная масса экскретируемой ДНК находилась в пределах 3,5x5 3,7x6 Да. Таким образом, данный эксперимент также свидетельствует в пользу гипотезы об активном процессе образования вкДНК. В году . . Федоров и И. С. Янева подтвердили возможность синтеза и экскреции ДНК лимфоцитами без фитомитогенов, отметив при этом незначительную интенсивность данных процессов Янева,. Хаитов с соавторами, анализируя динамику накопления ДНК в лимфоцитах больных с некоторыми заболеваниями респираторного тракта, установили, что при повышении концентрации ДНК в ядрах лимфоцитов, содержание сывороточной вкДНК тоже значительно увеличивается. Это позволило сделать вывод, что динамика содержания ДНК в сыворотке крови тесно связана с интенсивностью синтеза нуклеиновых кислот в лимфоцитах Хаитов, . Имеются данные, доказывающие, что не только активированные лимфоциты, но и фибробласты способны экскретировать ДНК , . Пытаясь ответить на вопрос, что является клеточным предшественником вкДНК, группа .