Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius

• Автор: Давыдов, Рустам Энверович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическое действие рибонуклеаз

1.2. Зависимость биологического действия рибонуклеаз от

ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ И КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

1.3. Взаимодействие рибонуклеаз и поликатионов с мембраной клеток.

1.4. Изменение физикохимических свойств рибонуклеаз путем их

ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ.

1.5. Участки мембраны клеток, взаимодействующие с рибоиуклеазами

1.6. Мишень РНКлз в клетках эукариот.

1.7. Заключение по обзору литературы.
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Рибонуклеаза i ii.
2.2. ДИАЛЬДЕГИДЦЕКСТРАН
2.3. ГЛУТАРОВЫЙ АЛЬДЕГИД.
2.4. Лабораторные животные и клеточные культуры
2.5. Методы синтеза модифицированной рибонуклеазы
2.5.1.Модификация РНКазы i альдегидсодержащими соединениями
2.5.2. Фотоокисление рибонуклеазы
2.5.3. Сукцинилирование рибонуклеазы. Получение препарата РНКаза iСц
2.5.4. Этаноламидирование с помощью карбодиимида. Получение препарата РНКаза iЭт
2.5.5. Модификация диметтсуберимидатом. Получение препаратов РНКаза iДМСИ мономер, димер и полимер
2.6. Определение выхода по белку рибонуклеазы, модифицированной
ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ
2.7. Определение числа связей ферментмодификатор.
2.8. Определение рибонуклеазной активности
2.9. Определение относительной константы ассоциации с гуаниловым нуклеотидом.
2 Калориметрические измерения препаратов
2 Определение термостабильности препаратов
2 Определение поверхностного натяжения
2 Распределение в двухфазной системе водабутанол.
2 Определение электрофоретической подвижности препаратов. .
2 Определение фракционного состава I 1Клзы модифицированной глутаровым альдегидом.
2 Определение цитотоксического действия препаратов РНКаз на культуре клеток i vi
2 Определение цитотоксичности препаратов i Жазы на культуре
КЛЕТОК I VIV
2 Измерение выхода ионов калия.,
2 Статистическая обработка результатов
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА ПГ ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ .II.
3.1. Оптимизация процесса модификации РНКазы I3i
ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ
3.2. Модификация РНКазы i с использованием низкомолекулярных модификаторов.
3.2.1. Разработка условий получения фотоинактивированной рибонуклеазы i
3.2.2. Модификация РНКазы Ы с использованием глутарового альдегида
ГЛАВА IV. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РНК АЗ
4.1. Свойства препаратов РНКазы В1 модифицированной
ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ С РАЗЛИЧНЫМИ ФУНКЦИОНАЛЬНОАКТИВНЫМИ ГРУППАМИ.
4.1.1.Физикохимические свойства препаратов РНКазы Вмодифицированной диальдегиддекстраном.
4.1.2. Цитотоксическое действие препаратов РНКазы В модифицированных диальдегиддекстраном.
4.2. Свойства мономерных модифицированных препаратов РНКазы Вк
4.2.1. Физикохимические свойства мономерных модифицированных препаратов РНКазы i
4.2.2. Цитотоксичностъ модифицированных мономерных форм РНКазы В1 т
4.2.3. Свойства гидрофобизированных препаратов РНКазы В.
4.3. Свойства препаратов РНКазы В1, различающихся молекулярной массой.
ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1.0ЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ И ИХ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ и энзиматические свойства.
5.2. Цитотоксичность модифицированных препаратов РНКаз.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


РНКаза i сукцинилированная РНКаза В. РНКаза iЭт этаноламидированная РНКаза В. РНКаза ВДАД РНКаза В. РНКаза ВДАД РНКаза В. РНКаза ВДАД РНКаза В. РНКаза ВДАДПА РНКаза В. РНКаза ВДАДФЬА РНКаза В. РНКаза iДАДДЭФДА РНКаза В. РНКаза ВГА РНКаза В. РНКаза iГАЭА РНКаза В. РНКаза ВГАГА РНКаза В. РНКаза iiГАПА фотоокисленная РНКаза В. РНКаза ВГАФБА РНКаза В. РНКаза ВДМСИ РНКаза В. РНКаза ВДМСИдимер димерная форма РНКазы В. РНКаза ВДМСИполимер полимерная форма РНКазы В. Актуальность проблемы К настоящему времени накоплен обширный материал по влиянию рибонуклеазы i ii на процессы жизнедеятельности клеток про и эукариот. Показано, что рибонуклеаза . Она обладает противовирусным, противоопухолевым и иммуностимулирующим действием стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, неспецифические факторы резистентности. Рибонуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и стимуляцию пролиферации некоторых клеток высших эукариот Куриненко, . В зависимости от концентрации РНКазы могут стимулировать или ингибировать размножение клеток микроорганизмов Солдатова, Беляева, Добротина и др. Колпаков, КуприяноваАшина, . Имеются экспериментальные доказательства того, что иммуностимуляция, стимуляция гемопоэза и пролиферации являются следствием взаимодействия фермента с клетками, в т. Использование фотоокисленной и инактивированной методом сайтспецифического мутагенеза рибонуклеазы . Куриненко, Кипенская, Ильинская, . Известна гипотеза, объясняющая механизм биологического действия нуклеаз проявлением каталитической функции РНКаз, в комплексе с аффинным и неснецифическим взаимодействием с плазматической мембраной Куриненко, . Очевидно, что степень выраженности биологических эффектов фермента на клеточном уровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью свойств плазматической мембраны клетки и физикохимических свойств фермента. Это предполагает, что изменение любого элемента указанной совокупности свойств, например физикохимических свойств фермента, может существенным образом отразиться на эффективности его взаимодействия с клеткой, и, следовательно, на биологической активности фермента. Одним из основных инструментов изменения физикохимических свойств белка является его химическая модификация. Методы химической модификации функциональноактивных белков успешно применяются для выяснения механизма их действия и представляют интерес как с точки зрения изучения влияния модификации на физикохимические и биологические свойства белка, так и с точки зрения решения фундаментальной проблемы биохимии о соотношении структуры и функции белка Овчинников, . Очевидно, что метод химической модификации особенно перспективен в этом плане для белков хорошо изученных в структурном отношении, каким и является рибонуклеаза i ii. Данные, полученные при изучении зависимости биологической активности фермента от структуры методами химической модификации, могут быть с успехом использованы для развития исследований на основе сайтспецифического мутагенеза. Плодотворность такого подхода продемонстрирована получением методом сайтспецифического мутагенеза серии мутантных по i форм РНКазы В. Ларионова, Торчилин, Чазов и др. Максименко, . Все вышеизложенное дает основание рассчитывать на плодотворность использования методов химической модификации для изменения физикохимических свойств РНКазы В. Цель и задачи исследований Целью исследования явилось изменение каталитически обусловленной биологической активности гуанилепецифичной РНКазы В. Разработать условия модификации РНКазы В. Исследовать энзиматические свойства, стабильность, гидрофобность и электрофоретическую подвижность препаратов РНКазы В. Изучить каталитически обусловленные цитотоксические свойства модифицированных препаратов РНКазы . Научная новизна работы. Впервые показана возможность направленного получения модифицированных ферментов с заданным числом связей фермент полимерный носитель с использованием носителя с одной степенью активации. Получены гидрофобизированные препараты РНКаз с высоким уровнем ферментативной активности.