Влияние факторов стресса на свойства нитратредуктаз микроорганизмов

• Автор: Морозкина, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микроорганизмы и условия стресса.

1.1.1. Температура как фактор стресса.

1.1.2. среды роста как фактор стресса.

1.1.3. Высокие концентрации солей как фактор стресса.

1.1.4. Изменение концентрации кислорода как фактор стресса.

1.1.5. Давление как фактор стресса.

1.1.6. Влияние химических факторов.

1.1.7. Влияние радиации.

1.2. Биотехнологическое применение организмов, выращенных в условиях стресса.
1.3. Нитратредуктаза ключевой фермент азотного метаболизма.
1.3.1. Ассимиляторная нитратредуктаза бактерий .
1.3.2. Дыхательная мембранносвязанная нитратредуктаза бактерий .
1.3.3. Диссимиляторная периплазматическая нитратредуктаза бактерий
1.3.4. Ассимиляторная нитратредуктаза эукариот.
1.3.5. Дисимиляторная нитратредуктаза эукариот.
1.4. Строение активного центра нитратредуктазы.
1.5. Изменение свойств и структуры нитратредуктазы под воздействием факторов стресса.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Реактивы, используемые в работе.
2.2. Объекты исследований и условия их выращивания.
2.2.1. i x штамм 1.
2.2.2. Дрожжи ii.
2.2.3. Бактерии . штамм .
2.3. Получение бесклеточного экстракта.
2.4. Выделение и очистка нитратредуктазы дрожжей ii, выращенных в присутствии 1 мМ вольфрамата.
2.5. Определение активности нитратредуктазы.
2.5.1. Определение активности метилвиологензависимой нитратредуктазы
2.5.2. Определение активности и зависимой нитратредуктазы.
2.6. Определение наличия молибдокофактора.
2.7. Определение молекулярной массы белков методом гельхроматографии.
2.8. Определение молекулярной массы и субъединичного состава белков методом электрофореза.
2.9. Определение ферментативной активности в ПААГ.
2 Определение вольфрама кинетическим методом.
2 Аналитические методы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Влияние парциального давления кислорода на свойства нитратредуктаз гриба i x 1.
3.1.1. Изменение функциональных характеристик азы у микроскопических грибов при стрессовых условиях снижение парциального давления кислорода.
3.1.2. Физиологобиохимические характеристики гриба . x 1 в аэробных и анаэробных условиях.
3.1.3. Сравнение свойств аз мицелия гриба . x 1, инкубируемого на нитрате в аэробных и анаэробных условиях.
3.1.4. Влияние циклогексемида на активность азы гриба
. x 1, инкубируемого в аэробных и анаэробных условиях на среде, содержащей нитрат.
3.2. Выделение, очистка и характеристика нитратредуктазы из клеток солетолерантного штамма дрожжей ii, выращенных в присутствии вольфрамата.
3.2.1. Влияние высоких 1 мМ концентраций вольфрамата на рост дрожжей . ii
3.2.2. Характеристика препарата нитратредуктазы из экстракта клеток дрожжей . ii, выращенных на 1 мМ вольфрамате.
3.2.3. Выделение и очистка нитратредуктазы.
3.2.4. Структура и свойства выделенной нитратредуктазы.
3.2.5. Защитные механизмы, обеспечивающие устойчивость дрожжей . ii к 1 мМ вольфрамату.
3.3. Выделение и характеристика новой, не содержащей молибден нитратредуктазы из галоалкалофильной бактерии . штамм .

3.3.1. Выделение и очистка НРазы из клеток галоалкалофильной
бактерии НаЬтопаэ эр. штамм АОЛ .
3.3.2. Физикохимические свойства НРазы из клеток галоалкалофильной бактерии Наотопаа вр. штамм АОЛ .
3.3.3. Спектр ферментативной активности НРазы бактерии Наотопаз вр. штамм АОЛ .
3.3.4. Анализ структуры НРазы бактерии На1отопаз эр. штамм АОЛ .
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список сокращений.
НРаза Нитратредуктаза
Мосо Молибденовый кофактор
Вольфрам
Мо Молибден
МУН Метилвиологен восстановленный
ВРВН Бромфеноловый голубой восстановленный
МЭН Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
МАРРН Никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный
БАЭ Флавинадениндинуклеотид
ПААГ Полиакриламидный гель
МаЭДТА Этилендиаминтетраацетат натрия
ЦГ Циклогексемид
ПАВ Поверхностноактивные вещества
ПЦР Полимеразная цепная реакция
АТР Аденозин трифосфат
РМЭБ Фенилметилсульфонилфторид
МЕйА 1 нафтилэтилендиамин дигидрохлорид
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


Показано, что солетолерантные дрожжи ii в ответ на воздействие 1 мМ вольфрамата способны синтезировать вольфрамсвязывающий белок, сорбирующий до 4,,9 мкг вольфрама мг белка. Синтезируемая при этом аза характеризуется необычной устойчивостью к высоким концентрациям вольфрама сохранение 0 ой активности при воздействии 1 мМ вольфрамата. Обнаружено, что аза галоалкалофильной денитрифицирующей бактерии . Штамм не содержит молибден и Мосо, характеризуется высоким температурным оптимумом С, повышенной термостабильностью и широкой субстратной специфичностью, что дает основание предполагать существование целого класса альтернативных безмолибденовых аз, обладающих сходными свойствами. Научнопрактическое значение. Полученные данные позволяют существенно расширить представление о влиянии факторов стресса на свойства ключевого фермента азотного обмена азу. Настоящая работа является фундаментальным исследованием, однако уникальные свойства исследуемых аз высокий оптимум температуры, высокая стабильность и термостабильность создают предпосылки для их практического применения в качестве биологических компонентов для очистки различных техногенных объектов. Апробация работы. России СанктПетербург, , на школеконференции Биология наука XXI века Пущино, . Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в числе которых 5 статей в ведущих российских журналах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 2 страницах. Список цитируемой литературы включает 1 наименование, в том числе 3 на иностранных языках. Иллюстративный материал содержит рисунков и 7 таблиц. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Микроорганизмы и условия стресса. С конца прошлого века изменения биосферы под влиянием хозяйственной деятельности стали одной из глобальных проблем человечества. Результатом антропогенного воздействия человека на окружающую среду стали значительные перестройки в системе биогеоценозов. Известно, что изменение экологической обстановки влияет на структуру, состав и взаимоотношения видов внутри экологических ниш. В связи с этим огромный интерес исследователей вызывает изучение влияние разнообразных факторов стресса на различные популяционные уровни экосистемы. Поскольку у более сложно организованных организмов ответ на воздействие стрессовых условий на совокупность процессов, обеспечивающих жизнедеятельность, может быть комплексным и проявляться со значительным запаздыванием, наиболее перспективными объектами для изучения данного влияния являются прокариоты и низшие эукариоты. Факторами стресса принято считать различные факторы, не являющиеся традиционными для жизнедеятельности данного вида микроорганизмов. Как правило, факторы стресса подразделяют на физические давление, температура, радиация и др. I, тяжелые металлы Табл. Ii i, . Выделенные из экстремальных экологических ниш микроорганизмы экстремофилы хорошо адаптированы к неблагоприятным факторам окружающей среды и представляют не только значительный теоретический интерес с точки зрения изучения механизмов адаптации организма к воздействию условий стресса, но и имеют важное прикладное значение, поскольку экстремофилы имеют огромный биотехнологический потенциал i ii, . Ферменты, выделенные из этих объектов экстремоферменты, как правило, обладают повышенной активностью, стабильностью, и могут функционировать при высоких концентрациях соли галоферменты, в условиях высокой щелочности алкалоферменты и других экстремальных условиях температура, давление, кислотность и т. Vii i, . Таблица 1. Классификация и примеры воздействия факторов стресса. Ацидофилы рост при рН2 ii i, . Алкалофилы рост при рН i, i i4, ii . Концентрации солей Галофилы экстремальные галофилы археи нуждаются в 2,,0 М I. Умеренные галофилы I. Давление Пьезофилы Пьезофилы растут при давлении 1 атм. МРа идо 0 МРа. Химические соединения Устойчивы к высоким концентрациям тяжелых металлов i . Устойчивы к высокому уровню газов например С .