Взаимодействие уникального домена высокомолекулярной киназы легких цепей миозина с белками-мишенями и его регуляция фосфорилированием

• Автор: Вилиткевич, Елена Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

Введение

Обзор литературы.

Подвижность немышечных клеток

Миозины II типа

Киназы легких цепей миозина

Гены КЛЦМ

Экспрессия КЛЦМ0 в тканях организма

Строение и функциональные свойства КЛЦМ0.

Аминотерминальный домен

Каталитический домен.
Регуляторный сегмент.
КМ домен и связывание с миозином
Связывание с актином.
Фосфорилирование КЛЦМ0.
Участие КЛЦМ0 в регуляции клеточной подвижности
Обоснование задачи.
Материалы и методы.
Материалы
Методы.
Молекулярнобиологические методы.
Генетическое конструирование фрагментов уникального домена
КЛЦМ0 для бактериальной экспрессии
Полимеразная цепная реакция ПЦР
Введение точечных аминокислотных замен.
Получение мутантов 7Г8 П.
Трансформация клеток . i.
Выделение плазмидной ДНК из клеток . i.
Биохимические и физикохимические методы.
Очистка рекомбинантных белков
Выделение белков из тканей.
Определение концентрации белков
Электрофорез и денситометрия.
Иммуноблоттинг.
Дифференциальное ультрацентрифугирование.
Измерение светорассеяния суспензии микротрубочек и агрегатов
тубулина
Электронная микроскопия белков. Исследование влияния
уникального домена КЛЦМ0 на микротрубочки
Фосфорилирование фрагментов КЛЦМ.
Определение участков фосфорилировапия в уникальном домене
КЛЦМ0 методом массспектрометрии.
Клеточнобиологические методы
Экстракции.
Результаты.
Создание генетических конструкций уникального домена КЛЦМ
Фрагмент 12 колокализуется с актином и микротрубочками в
немышечных клетках.
Фрагменты 11 и 7 колокализуются с актином в
немышечных клетках.
Сравнение защитного действия КЛЦМ0 и 12 на
микрофиламенты в культивируемых клетках
Связывание фрагмента 12 с актином и тубулином
Взаимодействие фрагментов 11 и 7 с Фактином i vi
Влияние 12 на сборку и взаимодействие микротрубочек
Влияние фосфорилирования уникального домена КЛЦМ0 протеин киназой А на его связывание с актином и микротрубочками i vi.
Фосфорилирование фрагмента 12 протеинкиназой А.
Фосфорилирование 12 протеинкиназой А практически не
влияет на его связывание с микротрубочками.
Фосфортглирование фрагмента 7 протеинкиназой А
Фосфорилирование 7 протеинкиназой А ослабляет его
связывание с актином.
Идентификация участков фосфорилирования протеинкиназой А в
уникальном домене КЛЦМ0
Взаимодействие фосфоимитирующих мутантов 7 с
цитоскелетом.
Активация протеинкиназы А в клетках сопровождается
уменьшением связывания 7 с цитоскелетом
Обсуждение
Новые участки связывания с компонентами цитоскелета в структуре
уникального домена КЛЦМ0.
Функциональное значение фосфорилирования уникального домена
КЛЦМ0 как интегратор цитоскелета и организатор клеточной
подвижности
Благодарности.
Список литературы


Обзор литературы. Строение и функциональные свойства КЛЦМ0. Каталитический домен. Регуляторный сегмент. Связывание с актином. Фосфорилирование КЛЦМ0. Обоснование задачи. Материалы и методы. Методы. Молекулярнобиологические методы. Введение точечных аминокислотных замен. Получение мутантов 7Г8 П. Трансформация клеток . Выделение плазмидной ДНК из клеток . Биохимические и физикохимические методы. Выделение белков из тканей. Электрофорез и денситометрия. Иммуноблоттинг. Дифференциальное ультрацентрифугирование. Электронная микроскопия белков. Фосфорилирование фрагментов КЛЦМ. КЛЦМ0 методом массспектрометрии. Экстракции. Результаты. Влияние фосфорилирования уникального домена КЛЦМ0 протеин киназой А на его связывание с актином и микротрубочками i vi. Фосфорилирование фрагмента 12 протеинкиназой А. КЛЦМ0. Благодарности. Список литературы. Этилен Киназа легких цепей миозина КЛЦМ является ключевым Са кальмодулин зависимым регулятором клеточной подвижности. Единственный известный субстрат этого фермента у эукариот основной молекулярный мотор клетки миозин II типа, а именно, его регуляторные легкие цепи. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина КЛЦМ приводит к активации моторного домена миозина, что необходимо для осуществления различных видов актомиозинзависимых двигательных реакций клеток и тканей, например, сокращения гладких мышц, локомоции фибробластов и лейкоцитов, цитокинеза, секреции, эндоцитоза, повышения проницаемости эпителиальных и эндотелиальных монослоев и др. В результате исследования организации гена немышечной гладкомышечной КЛЦМ было установлено, что помимо широкораспространенной 80 кДа киназы легких цепей миозина генетический локус КЛЦМ кодирует 0 кДа изоформу этого фермента КЛЦМ0. Эта изоформа экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках, эпителии кишечника и эндотелиальных клетках сосудов, в лейкоцитах и других немышечных клетках. В некоторых типах клеток, например, в эндотелии сосудов, КЛЦМ0 является единственной изоформой КЛЦМ. В то же время КЛЦМ0 отличается от КЛЦМ8 наличием уникального аминотерминального домена, состоящего из более чем 0 аминокислот. Анализ первичной структуры этого домена показывает отсутствие в нем типичных последовательностей каталитических доменов протеинкиназ и других ферментов и позволяет выделить в его составе шесть иммуноглобулиновых доменов и несколько повторяющихся мотивов. Известно, что иммуноглобулиновые домены ряда белков вовлечены в процессы белокбел кового узнавания, однако к началу данного исследования белкимишени уникального домена КЛЦМ0 не были обнаружены. В предшествующих работах было установлено, что повторяющиеся мотивы на самом Сконце уникального домена КЛЦМ0 участвуют во взаимодействии с актином, однако и в отсутствие этих мотивов Ыконцсвой домен киназы взаимодействовал с цитоскелетом, что подтверждало целесообразность поиска белковпартиеров КЛЦМ0 в клетках. Наконец, в первичной структуре уникального домена КЛЦМ0 был идентифицирован ряд потенциальных участков фосфорилирования различными протеинкиназами и экспериментально было показано, что такое фосфорилирование действительно происходит в живой клетке.