Взаимодействие фотоактивируемых и фосфорилирующих 5'-амидофосфатов мононуклеотидов с ферментами матричного синтеза нуклеиновых кислот

• Автор: Кудряшова, Наталья Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 122 с. : ил.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ФЕРМЕНТЫ БИОСИНТЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ АКТИВНЫЕ ЦЕНТРЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

1.1. Структура пипимефячнпгп игуиемя 1 1 Д а

1.2. Механизм полимеразной реакции

1.3. Сайтнаправленный мутагенез

1.4. Аффинная модификация ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот

1.4.1. Исследование ДНКполимераз с помощью производных ЫТР

1.4.1.1. Природные субстраты как аффинные реагенты ДНКполимераз

1.4.1.2. Производные дезоксинуклеозид5трифосфатов по гетероциклическому

основанию

1.4.1.3. Производные дезоксинуклеозид5трифосфатов по углеводному остатку

1.4.1.4. Модель стерических препятствий
1.4.1.5. Производные дезоксинуклеозид5трифосфатов по фосфатным остаткам
1.4.2. Исследование РНКполимераз с помощью производных ЫТР
1.4.2.1. Производные нуклеозид5трифосфатов по гетероциклическому основанию
1.4.2.2. Производные нуклеозид5трифосфатов по углеводному остатку
1.4.2.3. Производные нуклеозид5трифосфатов по фосфатным остаткам
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и методы
2.2. Определение активности ДНКполимераз
2.3. Определение активности РНКполимеразы II
2.4. Синтез фотоактивируемых аналогов нуклсозид5трифосфатов
2.5. Синтез 4Лг,Лгдиметиламинопиридиниевого производного АМР
2.6. Модификация РНКполимеразы II
2.6.1. Модификация РНКполимеразы П фотоактивирусмыми аналогами ИТР
2.6.2. Модификация РНКполимеразы II фосфорилирующим аналогом АМР
2.7. Изучение устойчивости у4азидо2,3,5,6тетрафторбензоил
аминоиропил фосфамидов V и VI
2.8. Изучение влияния дитиотреита на азидную функцию УУ4азидофенил
1,4диаминобугана, лазидотетрафтор и 5азидо2нитробензойной кислот
2.9. Выделение продуктов фотолитичсского разложения фосфамидов АТР
2 Модификация ДНКполимераз улазидоанилидом
2 Компьютерное моделирование структуры фосфамидов
. ГОУО1 1 ГХ v ЛД1Г1л i От
3.1. Синтез и свойства фотоактивируемых аналогов
3.1.1. Характеристика фосфоачидов
3.1.2. Стабильность фосфамидов
3.2. Взаимодействие ДНКполимеразы I .i и ее большого фрагмента с ул
азидоанилидом
3.2.1. Ингибирование ДНКполимераз с помощью улазидоанилида
3.2.2. Влияние облучения на активное состояние ферментов
3.2.3. Воздействие фотореагента на активность ДНКполимеразы I и большого
Ф фрагмента
3.3. Взаимодействие РНКполимеразы II с аналогами
3.3.1. Субстратные свойства производных в реакции транскрипции,
катализируемой РНКполимеразой II
3.3.2. Взаимодействие РНКполимеразы II с аналогами нуклеотидов в условиях
возможной модификации фермента
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПААТТрис УФсветЭДТЛ с1ЫТР ссМТР ЫТМР
аымр
ОМАРрА
ПолисА Олиго 1Т ЦМЭкарбодиимид
РЬ3Р
ИМБО
БОБ
К
ЯМР
ик
ОФХ
Не ДНКполнмераза ВИЧ
полиакриламидный гель трисгидроксиметиламинометан ультрафиолетовый свет этидендиаминтетрауксусная кислота дезоксинуклеозид5 трифосфат дидезо ксинуклеозид5трифосфат нуклеозид5триметафосфат дезоксинуклеозид5 монофосфат
4У Удиметиламинопиридинисвое производное аденозин5монофосфата
полидезоксирибоадениловая кислота
олигодезокситимидиловая кислота
УциклогексилЛгморфолинийэтилкарбодиимид
2, 2дипиридилдисульфид
трифенилфосфнн
димстилформамид
диметилсульфоксид
гидроксиэтил пиперазин1 этилсульфокислота
додецилсульфат натрия
константа Михаэлиса
константа ингибирования
каталитическая константа
ядерный магнитный резонанс
микроколоночная хроматография
инфракрасная спектроскопия
ионообменная хроматография
обращеннофазовая хромато1рафия
ДНКполимераза из экстремально термофильной бактерии
ТИегтм ИегторИИиз
вирус иммунодефицита человека
фермент
семейство обратных транскриптаз семейство ДНКполимеразы I . i базальные факторы транскрипции МН2конец полипептида СООНконец полипептида улазидоаннлид ТТР
v, vдиметнламинопиридинисвое производное АМР Аминокислоты трехбуквенное и однобуквенное написание и нуклеотиды приведены в общепринятом сокращении
Е I
ТВР, 1I, , 1I
конец
Сконец


ВВЕДЕНИЕ


Использование при конструировании реагентов реакционноспособных групп с нулевой длиной спенсера существенно повышает вероятность того, что произойдет модификация именно тех аминокислотных остатков, которые непосредственно контактируют с функциональной группой аналога субстрата. К таким типам реагентов относятся фосфорилирующие производные нуклеиновых кислот. Их достоинством также является образование ковалентных аддуктов, стабильность которых определяется природой модифицированного аминокислотного остатка. Это открывает возможность определения точки модификации на белке путем проведения реакции демодификации в разных условиях. До начала настоящей работы в качестве фосфорилирующих реагентов наиболее часто использовались имидазолиды мононуклеотидов 1, 2. Известно, что к эффективной атаке нуклеофильными группами аминокислотных остатков восприимчив только протонированный имидазолид нуклеотида. Если в роли нуклеофильного агента выступает остаток гистидина, то нельзя рассчитывать на высокую степень модификации изза образования ковалентных аддуктов, неустойчивых в условиях проведения аффинной модификации. Избежать этого затруднения позволяет замена имидазолида на амидофосфат с цвитгерионной группой на 5конце. Например, эффективность модификации РНКполимеразы . В связи с этим в данной работе нами для модификации РНКполимеразы II был опробован другой тип реагентов фосфорилирующее производное АМР с цвитгерионной группой на 5конце. В настоящее время полимеразы нуклеиновых кислот выделены из большого числа про и эукариотических клеток 4. Эти ферменты являются матричнозависимыми, т. ДНК или РНКполимеразе необходима матрица нативная двуцепочечиая ДНК в случае РНКполимеразы или репликативного комплекса, в состав которого входит, например, ДПКполимераза III . ДНК с короткими брешами такими, которые возникают в результате вырезания поврежденных участков одной из нитей ДНК во время ее репарации, как в случае ДНКполимеразы I . ДНКполимеразы человека, или РНК с тРНКнранмером в случае обратной транскриптазы. Вес полимеразы нуклеиновых кислот катализируют перенос нуклеотидного остатка от нуклеознд5трифосфата на 3гидроксильную группу растущей полимерной цепи, так что эти ферменты представляют собой нуклеотидилтрансферазы. Встраиваемый в Зкопец нуклсозид5монофосфат должен быть комплементарен считываемому элементу матрицы. Этим определяется точность синтеза дочерней нуклеиновой кислоты. При встраивании некомплементарного матрице ДПКполимераза использует механизм коррекции, гидролизуя некомнлементарный с помошыо Зэкзонуклеазной активности, присущей или самой ДНКполимеразе, или сс дополнительной субъединице. Ряд методов указывает на то, что полимеризующая и Зэкзонуклеазная если она присуща ДНКполимеразе активности ферментов связаны с разными активными центрами 5. Так, например, согласно данным рентгеноструктурного анализа, 3, 5экзонуклеазиый центр большого фрагмента ДНКполимеразы I . Сконцевой в А0 от экзонуклеазного центра 9. В обратной транскриптазе ВИЧ полимеразный и РНКазный Н центры разделены расстоянием в нуклеотидов II. У всех полимераз с известной пространственной структурой найдено, что полимеразный домен образует длинную образную щель, в которой может связываться ДНК 5, 9, , . Основание и стенки щели представлены тремя субдоменами, расположение которых напоминает полураскрытую кисть правой руки. По аналогии эти субдомены были названы ладонь , пальцы i и большой палец см. Здесь связываются также Зконсц праймера и сЫТР. Субдомен пальцы играет важную роль во взаимодействии с входящим нуклеозид5трифосфатом и с одноцепочечным участком матрицы, в то время как субдомен большой палец, повидимому, ответственен за взаимодействие с дуплексом ДНК, покидающим каталитический центр после реакции нуклеотидного переноса, за транслокацию и процессивность полимеразной реакции , . Рис. Схема трехмерной структуры большого фрагмента ДНКлолимеразы I . Спиральные участки полипептида представлены в виде цилиндров, складкив виде лент со стрелкой, указывающей направление цепи в складке от конца к Сконцу 9. А или семейство 1 включает в себя ДНКполимеразу 1 .