Введение антител в клетки и изучение их влияния на цАМФ-зависимую пртеинкиназу и казеиновую киназу

• Автор: Александрова, Наталья Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

I. Исследование цАМФзависимой протеинкиназы i vi.

1.1. Основные свойства каталитической субъединицы

I. 2. Строение регуляторной субъединицы.

I. 3. Основные свойства регуляторной субъединицы

I. 4. Иимунохимические свойства регуляторной субъединицы

I. 5. Свойства холофермента.

II. Исследование цАМФзависимой протекйщШазы i viv.

ЛУ С . . . 1

V vч.
II. 1. Биологическая роль различных типов цАМФзависимой
протеинкиназы
II. 2. Внутриклеточная локализация регуляторной субъединицы П
типа и ее взаимодействие с другими белками.
II. 3. цАМФзависимые протеинкиназы и пролиферация клеток
III. Пермеабилизация клеток дигитонином как метод введения в них различных веществ
МЕТОДЫ.
Список сокращений
МатериалыЛ.
Методы.
РЕЗУЛЬТАТЫ. .
I. Влияние специфических антител на свойства ГОСАII типа i vi
1.1. Характеристика МоАт
1.2. Взаимодействие МоАт с I мозга млекопитающих.

1.3. Влияние МоАт на образование холофермента
1.4. Влияние МоАг на присоединение цАМФ к I
1.5. Взаимодействие моноклональных антител с фиксированных клеток
1.6. Взаимодействие МоАт с нативным антигеном в экстракте
клеток РС.
II. Введение МоАт к 1I в живые клетки .
П.1. Пермеабшшзация клеточной мембраны.
.2. Введение белков в клетки РС т.
.3. Восстановление целостности клеточной мембраны
III. Действие введенных МоАт на активность ПКА и КК внутри клетки.
П. 1. Влияние МоАт внутри клеток на активность цАМФ
зависимой прогеиикиназы через 0,5 ч после введения.
П.2. Влияние МоАт на активность цАМФзависимой прогеиикиназы
через 4 ч после их введения в клетки .
1.3. Опосредованное влияние введенных в клетки МоАт к
на цАМФнезависимую казсинкиназу.
1.4. Активность цАМФзависимых и независимых протеинкиназ
в покоящихся и пролиферирующих клетках .
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


АМФзависимые протеинкиназы катализируют бисубстратную реакцию переноса уфосфата молекулы АТФ на гидроксильные группы остатков серина или треонина белка. Одним из субстратов является донор фосфата АТФ . ., . Значения Км для АТФ составляют 5 мкМ в зависимости от источника фермента, тогда как Км для других трифосфатов ГТФ, ИТФ, ЦТФ, УТФ на одиндва порядка выше . ., i . i . Для протекания фосфотрансферазной реакции необходимо присутствие ионов 2, оптимальная концентрация которых 13 мМ. Вместо ионов могут быть использованы ионы Со и 2 . ., , хотя величина для ПКА в присутствии ионов Мп2 в раз ниже, чем в присутствии 2 . Хсер или лизарглизаргХХсер Р. i . . ., . . Северин . ., . Если судить по относительной скорости фосфорилирования, то лучшими белковыми субстратами этого фермента являются Н2Ь из мозга свиньи . Относительная скорость фосфорилирования гистона Н1 8 Северин Е. С., . Меньшая концевая глобула образует участок связывания . В его состав входит так называемая глициновая петля три консервативных остатка глицина, необходимая для связывания нуклеотида. В Сконцевой глобуле молекулы фермента находится участок связывания субстрата. Присоединение к Ссубъединице изменяет ее конформацию и делает возможным ее связывание с белкомсубстратом i . ., . В настоящее время обнаружено три изоформы каталитической субъединицы Са, Су, являющиеся продуктами различных генов i . . i . Аминокислотные последовательности и М. ., а М. О., vi . ., . Су сильнее отличается от других изоформ, имея только гомологии с Са и с . ., . Са и . Су преимущественно экспрессируется в семенниках . ., . Несмотря на это, все три изоформы обладают одинаковой субстратной специфичностью и имеют сходные физикохимические свойства . ., . Перекрестная реакция моноклональных антител, полученных к Ссубъединице ПКА I, с Ссубъединицей ПКА II i . Ссубъединицы могут входить в состав холоферментов 1 и II типа. Строение регуляторной субъединицы. Различия между двумя типами ПКА обусловлены свойствами их регуляторных субъединиц, которые обозначают I и II, соответственно. К настоящему времени клонированы 4 гена субъединиц, кодирующие аир изоформы каждого типа i, I , I . . ., . ., . Они различаются по аминокислотному составу, физикохимическим и иммунологическим характеристикам. Ссубъединицы. Этим функциям соответствует одинаковая доменная организация их молекул. Ссубъединицы и два гомологичных домена, содержащих участки связывания цАМФ рис. Л иАМФсвязывающие домены. Каждый мономер регуляторной субъединицы содержит два цАМФсвязывающих участка, А и Б, расположенных в Сконцевой части молекулы ii . .. i . I . Высокая гомология их первичных структур позволила предположить, что они образовались в процессе эволюции путем дупликации генов. Присоединение по одной молекуле цАМФ к каждому мономеру приводит к образованию комплекса СгКгСчАМФ, который можно элюировать с ДЕАЕцеллюлозы и выделить в чистом виде. При этом цАМФ равномерно распределен между всеми участками его связывания. Активация такого комплекса наблюдалась при более низкой концентрации цАМФ, чем холофермента, не содержавшего цАМФ. Поэтому авторы предположили, что холоферменты, в которых насыщено центров связывания цАМФ, i viv в первую очередь реагируют на внутриклеточные колебания цАМФ С. Е., . Рис. Общая схема строения регуляторной субъединицы. На схеме указаны 4 домена регуляторной субъединицы два гомологичных участка связывания цАМФ А и Б участок взаимодействия с Ссубъединицей и Иконцевой домен, который взаимодействует с другими белками, а именно, со второй регуляторной субъединицей участок димеризации, с заякоривающими белками АКАР и антителами Ат.