Роль МАР-киназ в стимулируемой урокиназой миграции гладкомышечных клеток человека

• Автор: Гончарова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Физиологическая роль и механизмы клеточной подвижности
1.1 Физиологические аспекты клеточной миграции
1.2 Механизмы клеточной подвижности
1.2.1 Морфологическая поляризация клетки
1.2.2 Образование ламеллоподий ифилоподий
1.2.3 Динамика фокальных контактов в движущейся клетке
1.2.4 Перемещение клетки вперед за счет актомиозин-зависимого сокращения
2. Пути передачи миграционных сигналов
2.1 Пути передачи сигнала, опосредуемые факторами роста
2.1.1 Факторы роста и их рецепторы
2.1.2 Сигнальные пути, инициируемые рецепторами факторов роста
2.2 Передача сигнала внутрь клетки при связывании урокиназы с ее рецептором
2.2.1 Урокиназа, рецептор урокиназы, их участие в миграции клеток
2.2.2 Возможные пути передачи сигнала через рецептор урокиназы
2.3 Проведение сигнала через интегриновый рецептор
2.3.1 Строение и функции интегринов
2.3.2 Сигнальные пути, опосредуемые интегринами
2.4 МАР-киназные сигнальные каскады
2.4.1 р42/р44етк1’2 каскад
2.4.2 р38 каскад
2.4.3 МК/ШК каскад
2.4.4 Взамиодействие между компонентами МАР-киназных каскадов и их пространственная организация
2.4.5 Цитоскелетн ые субстрат ы МАР-киназ
3. Сократительный аппарат клетки и связанные с ним регуляторные белки
3.1 Структура сократительного аппарата гладкомышечной и немышечной клеток

3.2 Регуляция актомиозин-зависимого сокращения.

3.3 Кальдесмон
3.3.1 Строение и предполагаемая физиологическая роль калъдесмона
3.3.2 Регуляция активности калъдесмона фосфорилированием
3.4 Киназа и фосфатаза легких цепей миозина
3.5 Белки теплового шока (Hsp)
Экспериментальная часть
Материалы и методы
1. Материалы
1.1 Реактивы и материалы для биохимических и молекулярнобиологических исследований
1.2 Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований
2. Методы
2.1 Биохимические методы
2.1.1 Приготовление образцов клеток для электрофореза
2.1.2 Электрофорез
2.1.3 Изоэлектрофокусирование
2.1.4 Фосфорилирование С-концевого фрагмента калъдесмона Н1 активированной рекомбинантной p44erki МАР-киназой in vitro
2.1.5 Определение концентрации белка
2.2 Иммунохимические методы
2.2.1 Аффинная очистка антител к N-концевому фрагменту калъдесмона
N152
2.2.2 Иммуноблоттинг
2.2.3 Иммунофлуоресценция
2.2.4 Определение уровня фосфорилирования p42/p44erkl ,2 и р38 МАР-киназ
2.2.5 Определение уровня фосфорилирования РЛЦ
2.2. б Определение уровня фосфорилирования HSP27
2.3 Молекулярно-биологические методы
2.3.1 Создание конструкта pFLA G-CMV-2-N152
2.3.2 Транзиторная трансфекция эмбриональных фибробластов курицы конструктом pFLAG-CMV-2-N
2.3.3 Бактериальная экспрессия и выделение белков
2.4. Клеточно-биологические методы
2.4.1 Культивирование клеток

2.4.2 Связывание 125Iурокипазы и 1251 модифицированной формы урокиназы с рецептором
2.4.3 Миграция клеток
2.4.3.1 Миграция клеток в микрокамере Бойдена
2.4.3.2 Метод “царапин”
2.4.4 Выделение клеток из мускульного желудка куриного эмбриона
2.4.5 Вытеснение эндогенного капъдесмона его фрагментами из демембранированных клеток
2.5. Статистический анализ
Результаты исследования
1. Влияние урокиназы на миграцию ГМК
2.Изучение роли MAP-киназ в активации миграции ГМКурокиназой
2.1 Установление ключевой роли MAP-киназных каскадов в иРА-зависимой миграции ГМК
2.1.1 Активация MAP-киназ урокиназой в культивируемых ГМК
2.1.2 Участиер38 иp42/44erk!'2 MAP-киназ в миграции под действием г-иРА
2.2 Определение доменов урокиназы, необходимых для активации МАР-киназ
2.2.1 Влияние протеолитической активности урокиназы на активацию МАР-киназ
2.2.2 Влияние «ростового» и «крингл» доменов урокипазы на активацию МАР -киназ
3. Внутриклеточные мишени MAP-киназ, вовлеченные в клеточную миграцию
3.1 Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина
3.1.1 Стимуляция фосфорилирования РЛЦ миозина под действием r-иРА, г-IMW и r-uPA Q
3.1.2 Активация MAP-киназ и фосфорилирование РЛЦ под действием анизомицина
3.2 Влияние r-uPA на фосфорилирование HSP27
3.3 Влияние фосфорилирования кальдесмона MAP-киназой на его способность стабилизировать актомиозин in situ
3.3.1 Влияние фосфорилирования кальдесмона МАР-киназой на его связывание
с актином in situ

3.3.2 Колокализация N-концевого домена кальдесмона с миозином in vivo
3.3.3 Анализ взаимодействия кальдесмона с актомиозином в первичной культуре клеток мускульного желудка эмбриона курицы

В зависимости от типа клеток, активация MAP-киназных каскадов может происходить в клетке независимо друг от друга, либо активация одного сигнального пути может быть связана с параллельным ингибированием другого каскада (Lim and Zaheer, 1996; Zaheer and Lim, 1996). Повышение специфичности проведения сигнала достигается в клетке образованием пространственно упорядоченных комплексов протеинкиназ - представителей определенного каскада. Данная функция в клетке выполняется определенной группой белков, осуществляющих пространственную организацию MAP-киназного сигнального каскада.
Роль белков, осуществляющих пространственную организацию различных путей MAP-киназного каскада, заключается в тесной колокализации компонентов специфических MAP-киназных путей, приведении друг к другу определенных участников каскада и, таким образом, повышении эффективности фосфорилирования и активации компонентов каждого уровня. Такие белки-организаторы были изначально обнаружены в дрожжах (Choi et al., 1994; Marcus et al., 1994), а позднее - в клетках млекопитающих (Elion, 1998; Schaeffer et al., 1998; Whitmarsh et al., 1998; Yan et al., 1994).
Одним из представителей организующих белков является МР1 (партнер МЕК-1). Этот цитоплазматический белок способен одновременно связывать МКЬС МЕЮ и p42erk2 МАР-киназу и отвечать за специфическое усиление активации р42етк2 MAP-киназы (Schaeffer et al., 1998; Elion, 1998).
Другим белком, выполняющим сходные функции, является белок ЛР-1 (JNK-связывающий белок-1) (Whitmarsh et al., 1998). Этот белок локализуется в цитоплазме и способен связывать киназу МККК (НРК1), МККК (MLK3 или DLK), МКК7 и JNK, пространственно формируя всех участников JNK каскада (Whitmarsh et al., 1998).
Сходные функции может выполнять и МККК МЕКК1, активирующая как р42/р44егк1,2 МAP-киназы, так и JNK/SAPK сигнальные пути. МЕКК1 может связывать МКК4 и JNK/SAPK (Yan et al., 1994; Xu and Cobb, 1997), пространственно организуя JNK/SAPK путь передачи сигнала.
Организующие белки и механизмы их действия изучены еще недостаточно, однако не вызывает сомнений, что они играют определяющую роль в направлении сигнала по определенному MAP-киназному пути.
2.4.5 Цитоскелетные субстраты МАР-киназ.
В последние годы было показано, что р42/р44етк1,2 и р38 MAP-киназы фосфорилируют белки, связанные с актиновым цитоскелетом и регулирующие актомозиновое сокращение.