Бактериальные рибонуклезы как индукторы дифференциальных токсических изменений клеток различного уровня организации

• Автор: Зеленихин, Павел Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая активность рибонуклеаз.

1.1.1. Роль рибонуклеаз в регуляции экспрессии генов.

1.1.2. Защитные функции рибонуклеаз

1.2. Цнтотоксичныс рибонуклеаз различных организмов

1.2.1. Механизмы цитотоксичности рибонуклеаз

1.2.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности

рибонуклеаз.

1.3. Иммуногенные эффекты рибонуклеаз.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы
2.1.1. Ферментные препараты
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Клеточные культуры
2.2. Методы определения токсического и генотокснческого
действия РНКаз в прокариотических тестсистемах.
2.2.1. О цепка токсичности фер.ментных препаратов по выживаемости
тестерных штаммов грамотрицательных и грамположнтельных
микроорганизмов.
2.2.2. Оценка токсичности ферментных препаратов но ингибированию уровня конститутивных ферментов
2.2.3. Тестирование на мутагенность в бактериальных тсстсистсмах
2.2.3.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций.
2.2.3.2. хромотест
2.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур
2.4. Цнто,метрическое определение апоптичсских клеток.
2.5 Визуализация апоптичсских изменений клеток с помощью методов микроскопии.
2.5.1. Микроскопическое исследование апоптических изменений клеточной морфологии.
2.5.2. Микроскопия с использованием витального окрашивания флуоресцентным красителем .С1
2.5.3. Прямая регистрация уровня внутриклеточного Са с помощью флуорохромного агента Р1ЖА2.
2.6. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем иоле
2.7. Цитометрическое исследование индукции несиецифичсского иммунного ответа
2.8. Статистическая обработка результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Токсические и генотоксическис эффекты микробных рибонуклеаз
3.1.1. Токсические эффекты рибонуклеаз
3.1.2. Индукция генных мутаций рибонуклеазами в тесте Эймса
3.1.3. БОБиндуцирующая активность рибонуклеаз
3.2. Апоптозиндуцирующее действие микробных рибонуклеаз на нормальные и малигнизироваииыс клетки эукариот
3.2.1. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на нормальные и опухолевые клетки крови
3.2.2. Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеаз на клетки
солидных опухолей.
3.3. Оценка жизнеспособности клеточных культур при росте в присутствии микробных РНКаз.
3.4. Апоитотические изменения морфологических и физиологических характеристик клеток под действием
рибопуклсазы i iii
3.5. Рибонуклаза i iii как индуктор поликлонального Тклсточного ответа.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На основе полученных данных оценить вклад отдельных молекулярных детерминант, а именно катионности и каталитической активности РНКаз в апоптогенное и цитотоксическое действие ферментов. Научнаи новизна. Впервые установлены токсические эффекты по отношению к грамположительным и грамотр и нательным бактериям высоких концентраций биназы, ее мутанта и катионных мутантов РНКазы 5К, 7К. Впервые показано генотоксическое действие катионных бактериальных РИКаз в тесте Эймса по индукции мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у бактерий ii ТА 0 и в тесте по индукции ответа у ii i , при этом генотоксические свойства коррелировали с поверхностным зарядом молекулы фермента. В работе впервые с помощью методов проточной цитометрии, электрофореза в пульсирующем поле и дифференциального окрашивания зафиксировано апоитозиндуцирующее действие биназы по отношению к клеткам солидных опухолей карцинома легких А9 и клеткам миелогенного лейкоза К2 и проведен сравнительный анализ апоптогенной активности РНКазы по отношению к нормальным и опухолевым клеткам. Установлено, что в отношении нетрансформированных аналогов опухолевых клеток фермент не проявляет апоптозиндуцирующих свойств. Впервые охарактеризован решающий вклад в апоптогенность биназы ее каталитической активности, то есть показано, что необходимым условием апоптогенности фермента является расщепление доступной клеточной РНК. Апоптические свойства катионных мутантов РНКазы и биназы продемонстрированы в отношении клеточных линий нормальных и трансформированных фибробластов, а также эмбриональных клеток почек человека, нормальных и искусственно экспрессирующих гены кальцийзависимых калиевых каналов, роль которых представляется важной для реализации цитотоксичности РНКаз. Впервые выявлено, что биназа, а также ее мутант с пониженной каталитической активностью не индуцировали экспрессии специфических маркеров иммунного ответа и уинтерферона в популяции 8 и 4 Тлимфоцитов, что свидетельствует об отсутствии у цитотоксичных ферментов свойств индуктора поликлонального Тклеточного ответа по типу суперантигсна. Практическая значимость. Актуальность проблемы раковых заболеваний заставляет вести постоянный поиск новых препаратов и подходов для лечения злокачественных новообразований, поэтому любая возможность получения новых щадящих средств противоопухолевой терапии, избирательно поражающих злокачественные клетки, имеет несомненную практическую ценность. Настоящая работа особенно важна в связи с тем, что обосновывает индукцию бактериальными РНКазами преимущественной гибели опухолевых клеток путем апоптоза, не нарушающего функционального состояния нормальных тканей организма. В данной работе обоснована возможность получения препаратов с селективным апоптозиндуцирующим действием в отношении малигнизированных клеток на базе каталитически активных катионных микробных РНКаз. ДНКповреждающим химиотерапевтическим агентам. Установленное отсутствие у биназы свойств инициатора неспецифического иммунного ответа позволяет в первом приближении обосновать возможность использования этого фермента, а также биоинженерных конструкций на его основе в терапии опухолевых заболеваний. О. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение гг. НИР КГУ гос. Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения. Исследования автора как исполнителя данной тематики поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований 5, фонда Североатлантического союза Ь8Т. СГ0. Университеты России фундаментальные исследования ур. Республики Татарстан НИОКР АН РТ 3. Конструирование противоопухолевых препаратов селективного действия на основе микробных рибонуклеаз и Центр коллективного пользования КГУ . Развитие научного потенциала высшей школы РП. Авторские исследования получили персональную поддержку фонда Палаты депутатов г. Берлина гг.