Разработка новых подходов к изучению "слабого" связывания миозина с актином

• Автор: Росткова, Елена Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление
Список использованных
Введение
Обзор литературы
1.1. Структура и основные свойства актина
1.1.1. Биологическая характеристика актина
1.1.2. Функциональные свойства актина. Полимеризация
1.1.3. Структура молекулы актина
1.1.3.1. Участки связывания лигандов
Катион-связывающий участок15 У часток связывания нуклеотидов
Участки взаимодействия между мономерами актина
Участки взаимодействия с актин-связывающими белками 18 Участки связывания токсинов
1.2. Структура и основные свойства тропомиозина
1.3 Структура и основные свойства миозина
1.3.1. Строение молекулы миозина
1.3.2. АТРазная активность миозина
1.3.3. Стабильные аналоги интермедиатов Б1**-АОР-Р[
и Б1*-АТР
1.4. Взаимодействие миозина с актином
1.4.1. Молекулярный механизм подвижности
1.4.2. “Слабое” и “сильное” связывание миозина с актином
1.4.3. Регуляция сокращения
1.5. Применение метода дифференциальной сканирующей
калориметрии для структурных исследований мышечных белков:

Миозин
Актин
Тропомиозин
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы
2.1. Получение препаратов белков
2.1.1. Выделение миозина из скелетных мышц кролика
2.1.2. Получение субфрагмента 1 (81) миозина из
скелетных мышц кролика
2.1.3. Выделение актина из скелетных мышц кролика
Получение ацетонового порошка
Выделение актина из ацетонового порошка
2.1.4. Приготовление препарата гладкомышечного тропомиозина
2.1.5. Разделение гладкомышечного тропомиозина на изоформы
2.2. Используемые биохимические методы
2.2.1. Формирование стабильных тройных комплексов
81 с АБР и аналогами Р[
2.2.2. Определение АТРазной активности миозина
2.2.3. Пиреновая модификация актина
2.2.4. Измерение концентрации белка микробиуретовым методом
2.3. Использованные методы исследования
2.3.1. Кинетические методы исследования
2.3.2. Исследования тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
2.3.3. Исследование температурных зависимостей диссоциации комплекса Р-актина с тропомиозином по изменению интенсивности светорассеяния
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Кинетические исследования “слабого” связывания
головок миозина с Р-актином

3.1.1. Исследования скорости образования тройных комплексов 81 - АИР-АН“ и Б1 -АИР-ВеРх в отсутствие и присутствии
Р-актина
3.1.2. Доказательство “слабого” связывания комплексов
81-АОР-ВеРх и 81-АОР-А1Р4' с Р-актином
3.1.3. Сравнительный кинетический анализ “слабого” связывания с Р-актином тройных комплексов
Б1 -АИР-ВеРх и 81 - АИР-АН
3.2. Структурные исследования тропомиозина из гладких
мышц утки и его комплексов с Р-актином
3.2.1. Тепловая денатурация комплекса ТМ - Р-актин
3.2.2. Тепловая денатурация связанного с актином ТМ
при различных молярных отношениях ТМ: актин
3.2.3. Влияние разведения комплекса ТМ - Р-актин на
тепловую денатурацию связанного с актином ТМ
3.2.4. Исследование тепловой денатурации гомодимеров
ТМ в комплексе с Р-актином
3.2.5. Исследование процесса тепловой денатурации
комплекса Р-актин - ТМ в присутствии кальдесмона
3.2.6. Изучение методом ДСК комплекса Р-актин
в присутствии Б1
Заключение
Выводы
Список цитированной литературы

цикла; 2) головка плотно присоединена к актину, что имеет место в конце рабочего цикла, после диссоциации Pj[ и ADP. Второе состояние носит название „сильного“ (rigor), так как в этом случае связывание миозиновой головки с актином очень крепкое. Начальное состояние называют „слабым“ связыванием, так как в этом положении сродство к актину гораздо ниже (Geeves, Conibear,
1995).
„Сильное“ связывание миозиновой головки с актином (в отсутствие связанного нуклеотида) достаточно хорошо изучено (Moore et al., 1970; Milligan, Flicker, 1987), в то время как изучение „слабого“ взаимодействия осложняется тем, что связывание АТР приводит к быстрой диссоциации миозиновых головок от актина. Электронно-микроскопические исследования актина, декорированного фрагментами S1 гладкомышечного миозина, показали, что в процессе гидролиза АТР происходит поворот миозиновой головки на 30-35° (Jontes et al., 1995). Предполагается, что основное перемещение удлиненной “шейки” головки (в последнее время часто также называемой “lever arm”) происходит при высвобождением фосфата, а этот шаг сопряжен со значительным изменением свободной энергии молекулы миозина; некоторые этапы такого движения могут быть также связаны с высвобождением ADP. Эти данные были подтверждены результатами недавних экспериментов, полученных при использовании спиновой метки, прикрепленной к легкой цепи миозина (Gollub et al., 1996). Очищенный SI, иммобилизованный на подложке, способен осуществлять движение актиновых филаментов в присутствии АТР в экспериментах in vitro motility. Было показано, что скорость такого перемещения актиновых филаментов пропорциональна длине шейки головки („lever arm”) (Uyeda et al., 1996). Сходные результаты были получены в лаборатории Д. Манштейна с использованием мутантных фрагментов миозиновой головки, в которых “шейка” головки (участок связывания легкой цепи) был заменен на повторные последовательности а-актннина (Anson et al
1996). Кроме того, предполагается, что “шарнир”, в котором происходит поворот шейки (“ lever arm“ ) относительно глобулярного моторного домена