Анализ нуклеазной фрагментации хроматина кодирующих областей генов триптофандиоксигеназы (to) и тирозинаминотрансферазы (tat) в различных функциональных состояниях

• Автор: Павлова, Евгения Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 103 с. : ил.

В первых исследованиях, проведнных на глобиновых и овальбуминовых i, i, i, x, , , , а также рРНК генах i, v, v, i i, , 1 с использованием ещ техники гибридизации в растворе, не было обнаружено различий между активным и репрессированным их состояниями по скорости переваривания ДНК МНазой и е распределению в спектре фрагментов, кратных структурной единице. В ряде работ отмечался более быстрый распад части активного хроматина до моно и коротких олигонуклеосом , Постников и др. В последующих анализах при визуализации МПазных фрагментов большого числа активных генов методом блотгибридизации были получены крайне пртиворечивые результаты , , , . Так, существуют данные, подтверждающие как неизменность позиций нуклеосом и длины нуклеосомного повтора по тесту МНазной чувствительности в хроматине кодирующих областей при активации гена , , , , , , так и его удлинении или укорочении I , , существование нескольких фаз нуклеосомного устройства на экспрессируемой ДНК . Обнаружены нарушения нуклеосомной повторяемости МНазных разрывов i, , , а также продукция фрагментов монотонно убывающих по длине , i , , , , , iii , i , i . Из всей совокупности данных следует, что значительная часть ДНК генов, программированных на экспрессию в специализированных клетках, устойчива к действию МНазы. Однако противоречивость результатов не позволяет придти к определенному заключению о характере распределения МНазочувсгвительных сайтов в их кодирующих областях. Кроме того, использование различных нуклеаз ДНКазы I и МНазы в анализе структуры активного хроматина привело к взаимоисключающим суждениям. В качестве причин неоднозначности результатов рассматривают множественность состояний, в которых могут быть представлены индивидуальные гены и их участки в клеточной популяции i , . Одновременное присутствие в однотипных клетках репрессированной, компетентной и транскрибируемой форм показано для некоторых повторяющихся генных кластеров , i , , , i , . Того же можно ожидать для уникальных генов, индуцируемых к транскрипции от репрессированного состояния в интерфазе. ДНК , создают дополнительные трудности в оценке наблюдаемых xi его фрагментации экзогенными ферментами. Противоречивость данных по организации структурных единиц хроматина нуклеосом на различных ступенях активации гена не позволяет придти к определенному заключению о механизмах эукариотической транскрипции. Удобной моделью для сравнения характера нуклсазной фрагментации в составе ядер активного и репрессированного хроматина являются гены и i . Эти гены представлены одной копией в геноме крыс. Их экспрессия тканеспецифична и две ступени активации разделены во времени. Состояние компетентности к транскрипции устанавливается только в предшественниках гепатоцитов на конечных стадиях эмбриогенеза и сохраняется при последующих клеточных генерациях. Транскрипция индуцируется в раннем постнатальном развитии i . Такая система регуляции и генов исключает присутствие в клетках печени взрослых животных их репрессированных форм. Целью дайной работы явился сравнительный анализ доступности ДИК в кодирующих областях и генов для фрагментации МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II, различающихся по механизму нуклеолитичсского действия, в активном, компетентном к транскрипции и репрессированном состояниях в ядрах клеток печени и мозга новорожднных и взрослых крыс. Получение ДНКЗОндов сегментов кодирующих областей и генов из содержащих их рекомбинантных плазмид. Мечение ДНКзондов флуоресцирующим агентом при амплификации в системе со случайными праймерами. Сравнение длины фрагментов ДНК общего репрессировнного и активного и генов хроматина, продуцируемых МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II в ядрах клеток печени взрослых крыс при различных концентрациях ферментов. Сравнение характера фрагментации гена МНазой и ДНКазой I в репрессированном в ядрах клеток мозга и активном ядрах клеток печени состояниях. Сравнение длины фрагментов гена , продуцируемых МНазой и ДНКазой I в компетентном к транскрипции в ядрах клеток печени новорожднных крыс и репрессированном в ядрах клеток мозга состояниях.