Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP

• Автор: Серебряная, Дарья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АКТОМИОЗИНЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ

ПОДВИЖНОСТИ И СОКРА ТИМОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ.

1.1 Актомиозиновый цитоскслет механическая основа движения клеток

1.2. Актин и миозин II главные сократительные белки клетки.

1.3. Фосфорилирование РЛЦ ведущий механизм активации миозина.

1.4. Ферменты, регулирующие уровень фосфорилирования миозина II
1.4.1. Киназа легких цепей миозина КЛЦМ
1.4.2. ЯИоактивируемая киназа ЯИокиназа
1.4.3. Другие Са независимые протеинкиназы
1.4.4. Фосфатаза легких цепей миозина ФЛЦМ.
1.4.5. Химические ингибиторы ферментовмодуляторов активности миозина II .
2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИОЗИНА II В
СОКРАТИТЕЛЬНОМ АППАРАТЕ ГЛАДКИХ МЫШЩ.
2.1. Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц.
2.2. Факторы, препятствующие деполимеризации миозиновых филаментов гладких мышц
2.3. Особенности регуляции сокращения гладких мышц под действием фосфорилирования РЛЦ миозина
2.4. Пермеабилизованные гладкомышечные волокна как модель исследования регуляции сокращения гладкой мускулатуры
3. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
МИОЗИНА IIВ НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ.
3.1. Двигательные реакции в миграции немышечных клеток.
3.2. Распределение структурных элементов миозина II в мигрирующей клетке.
3.3. Пространственная регуляция фосфорилирования РЛЦ миозина II в клетке
3.4. Экспериментальные подходы к исследованию механизмов миозин II зависимой подвижности немышечных клеток.
4. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА КЯР ТЕЛОКИНА
4.1. Струкгура КЯР.
4.2. КЯР как эндогенный регулятор активности миозина II
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. МАТЕРИАЛЫ.
1.1.Реактивы и материалы для биохимических и молекулярнобиологических исследований
1.2.Реактивы и материалы для клеточнобиологических исследований.
1.3. Реактивы и материалы для физиологических исследований.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1 Биохимические методы.
2.1.1. Определение концентрации белка
2.1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецшсульфата натрия ДСНэлектрофорез
2.1.3. Мочевинноглицерольный электрофорез.
2.1.4. Иммуноблоттинг
2.1.5. Приготовление образцов клеток и гладкомышечных волокон дляДСНэлектрофореза
2.1.6. Приготовление образцов из гладкомышечных волокон и 3 фибробластов для мочевипноглицеропьного электрофореза.
2.1.7. Экспрессия и очистка рекомбинантного и его мутантных форм
2.1.8. Фосфорилирование i vi.
2.1.9. Получение , меченого 5I.
2.2. Молекулярнобиологические методы.
2.2.1. Создание и характеристика молекулярногенетических конструкций
2.3. Клеточнобиологические методы
2.3.1. Культивирование фибробластов линии I ЗТЗ
2.3.2. Транзиторная трансфекция фибробластов линии I
2.3.3. Получение трансгенных фибробластов линии I ЗТЗ, стабильно экспрессирующих и
2.3.4. Направленная миграция в камере Бойдена
2.3.5. Адгезия фибробластов на иммунологические планшеты покрытые коллагеном
I типа.
2.3.6 Измерение миграции клеток методом зарастания царапины .
2.3.7. Измерение сократительной активности фибробластов в коллагеновом матриксе.
2.3.8. Экстракция растворимого миозина из клеток с помощью Тритона X0.
2.3.9. Вычисление линейных параметров ядер и объема фибробластов линии 3
2.4. Физиологические методы.
2.4.1. Получение препарата i i, пермеабилизованного Тритоном Х
2.4.2. Измерение сократительной активности i i
2.4.3. Приготовление препаратов i i с меченым для флуоресцентной микроскопии
2.5. Количественная обработка изображений и статистический анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. ВЛИЯНИЕ НА СОКРАТИМОСТЬ СКИЦИРОВАННЫХ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ
ВОЛОКОН.
1.1. Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц i i
1.2 .Влияние на Са2независимое сокращение, вызванное микроцистином
1.3.Влияние на Са2зависимое сокращение и расслабление.
1.3.1. Эффекты полноразмерного и фосфорилированного расслабление скинированных волокон.
1.3.2. Релаксирующие эффекты мутантных форм .
2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НА МОДЕЛИ
ТРАНСГЕПНЫХ КЛЕТОК.
2.1 .Получение и характеристика трансгенных по фибробластов.
2.2. Влияние на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах.
2.3. Влияние на количество полимерного миозина II в фибробластах
2.4. Роль Скондевого домена в рефляции функционального состояния миозина II в клетках
2.5. Влияние на подвижность и сократимость трансгеиных фибробластов.
2.6. Сконцевая последовательность необходима для стимуляции хемотаксиса фибробластов
2.7. Внутриклеточные эффекты связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ и, возможно, iкиназой, но не киназой
2.7.1. Влияние на фосфорилирование миозина при ингибировании киназ РЛЦ миозина.
2.7.2. Влияние на двигательные реакции клеток при ингибировании киназ РЛЦ миозина.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИОЗИНА II В КЛЕТКЕ ПОД
ДЕЙСТВИЕМ .
2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ ОБУСЛОВЛЕНЫ ЕГО ПРЯМЫМ
СВЯЗЫВАНИЕМ С МИОЗИНОМ.
3. ПРЕПЯТСТВУЕТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЮ РЛЦ МИОЗИНА В КЛЕТКЕ
4. РОЛЬ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИОЗИНА II В АКТОМИОЗИН
ЗАВИСИМОЙ ПОДВИЖНОСТИ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Этот тип, условно обозначаемый как амебоидный, в чистом виде характерен только для некоторых эукариотических клеток, таких как кератиноциты и нейтрофилы, и морфологически выглядит как перетекание клетки по субстрату. Такой способ движения основан на обратимой полимеризации актина и является в настоящее время предметом пристального внимания, но выходит за рамки данной работы и будет лишь кратко проанализирован в одном из разделов обзора литературы. Далее под термином клеточной подвижности мы будем понимать форму актомиозинзависимой подвижности, наиболее характерной для таких клеток с ярко выраженной структурой цитоскелет и адгезивными свойствами, как фибробласты. Именно поэтому эти клетки были выбраны нами в качестве объекта исследования. Как и большинегво клеток организма, фибробласты используют актииовый тип подвижност и как одну из важных компонент для поляризации и начальной фазы движения, но затем привлекают миозин II для координированного перемещения тела клетки и подтягивания ее задней части на заключительных этапах цикла миграции. Предполагается, что при этом миозин И шрает важную роль как в структурной организации одиночных филаментов актина в пучки стрессфибрилл, так и их связи с адгезивными контактами. Натяжение стрессфибрилл вследствие сократительной активности актомиозина является существенным элементом как движения этих клеток, так и формирования прочных адгезивных контактов. Однако, эти аспекты функционирования миозина И в настоящее время исследованы мало, особенно это касается структурной роли миозина II. Полученные результаты далее могут быть использованы для анализа поведения немышечных клеток при аналогичных воздействиях, и дать возможность вычислить, дедуктивным путем, роль структурной компоненты в клеточной подвижности. Такой сравни тельный анализ и был применен в настоящей работе. Для реализации функций нсмышсчного и гладкомышечного миозина II типа требуется активация, для которой необходимо и достаточно фосфорилирования единственного остатка регуляторных легких цепей РЛЦ миозина. В результате активации молекула миозина претерпевает конформационное изменение, которое одновременно включает как моторную активность, так и разрешает спонтанную ассоциацию миозина II в филаменты. С неразрывностью этих двух событий связана трудность анализа индивидуальной значимости каждой из составляющих для клеточной подвижности. Мы предположили, что нужного разобщения этих процессов можно достигнуть используя свойства белка i i, или телокин, который взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозином i vi и подавляет фосфорилирование его РЛЦ, но вызывает при этом полимеризацию миозина в филаменты. В связи с этим, в начале мы использовали модель скицированной гладкой мускулатуры для определения избирательного эффекта только на моторную функцию миозина II. Затем нашей задачей было создать модель трансгенных фибробластов с гетерологичной экспрессией и показать, что этот белок регулирует состояние миозина II именно так, как это следует ожидать из результатов экспериментов i vi, а также исследовать двигательный фенотип таких клеток. Мы предполагали, что дифференциальный анализ эффектов в этих системах позволит нам выявить функциональную роль структурной организации миозина II в клеточной подвижности. Наконец, важной составляющей каждого раздела работы было проследить, связаны ли эффекты на миозин II с прямым взаимодействием этих белков, в котором главную роль играет Сконцевая последовательность , или может действовать иначе, например, используя фосфорилирование своей концевой последовательности, не являющееся критическим для связывания с миозином. Таким образом, целью нашего исследовании было выяснение механизма функционирования миозина II в клеточной подвижности с использованием двух экспериментальных систем и белка в качестве инструмента для разобщения структу рной и моторной функций миозина II. В модели скицированных гладких мышц мы исследовали избирательное действие на сократительные свойства актомиозина, а в модели трансгенных фибробластов линии I действие на актомиозинзависимую клеточную подвижность.