Автономные и ассоциированные с ДНК-полимеразами 3'→5'-экзонуклеазы в филогенезе

• Автор: Ронжина, Наталья Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Гатчина
• Количество страниц: 165 с. : ил

Введение.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Классификация нуклеаз.

Глава 2. Распространение и функции экзонуклеаз и их

мультиферментных комплексов с ДНКполимеразами

1. ДНКполимеразы и экзонуклеазы вирусов и

бактериофагов.

2. Бактериальные ДНКполимеразы и экзонуклеазы.

3. ДНКполимеразы и экзонуклеазы архебактерий

4. Эукариотические ДНКполимеразы и экзонуклеазы.

ДНКполимеразы

Автономные экзонуклеазы.
Комплексы ДНКполимераз и АЭ
Глава 3. Биологическая роль У5экзонуклеаз.
1. Экзонуклеазная коррекция ДНКполимеразного синтеза.
Антимутагенная роль экзонуклеаз i viv
Экзонуклеазная коррекция а и полимеразного синтеза
Вклад АЭ в точность ДНКполимераз, содержащих собственную
У5экзонуклеазную активность.
Корректорская роль автономных экзонуклеаз в составе
ДНКполимеразных комплексов.
2. Пострепликативная коррекция гетеродуплексов
3. Участие экзонуклеаз в репарации повреждений ДНК.
Эксцизионная репарация оснований
Эксцизионная репарация нуклеотидов
4. Участие экзонуклеаз в рекомбинации ДНК.
Часть 2. Материалы и методы
Глава 1. Материалы
1. Объекты исследования.
2. Реактивы и препараты.
3. Субклеточные препараты.
4. Получение 3меченной ДНК.
5. Ферменты.
Глава 2. Методы исследования
1. Гельфильтрация экстрактов на колонке с сефакрилом .
2. Хроматография экстрактов печени крысы на колонке с ДЭАЭ
сефадексом А
3. Определение активности ферментов.
Определение ДНКполимеразной активности.
Определение нуклеазной активности.
Определение экзонуклеазной активности и доли
активности АЭ в присутствии эндонуклеаз.
4. Статистическая обработка результатов.
5. Метод определения концентрации ДНК.
Часть 3. Результаты и обсуждение
Глава 1. Определение доли активности АЭ в бесклеточных экстрактах 1. Объект исследования бесклеточные экстракты, подвергнутые
гельфильтрации.
2. Влияние примеси холодной ДНК, присутствующей в
экстракте, на его нуклеазную активность.
3. Роль протеолиза в оценке доли активности АЭ
4. Определение экзонуклеазной активности в присутствии
эндонуклеаз.
Схемы реакции расщепления 3меченной и равномерно
меченной ДНК экзонуклеазой и эндонуклеазой
Характеристика субстратов нуклеазной реакции 3меченной и
равномерно меченной ДНК
Схема экзонуклеазной реакции.
Схема эндонуклеазной реакции.
Определение соотношения экзонуклеазной активности и
эндонуклеазной активности в пробе.
Измерение экзонуклеазной активности ДНКполимеразы
фага Т4.
Измерение активности ДНКазы
Измерение активности экзонуклеазы ДНКполимеразы фага Т4 и ДНКазы I, содержащихся в смсси в различных
соотношениях.
5. Примеры расчета доли активности АЭ, содержащейся в
экстракте, по хроматограмме.
Количественный метод определения доли экзонуклеазной активности от общей нуклеазной активности в присутствии
эндонуклеаз и доли активности АЭ в исследуемых образцах.
Доля активности АЭ в экстракте пищеварительной железы рака
Гельфильтрация в квазифизиологических условиях.
Гельфильтрация в гидрофобизированных условиях
Гельфильтрация в полярных условиях
Доля активности АЭ в экстракте дрожжей
vii
Глава 2. Гельфильтрация экстрактов на колонке с сефакрилом 0 и влияние хроматографической среды на диссоциацию АЭ из
высокомолекулярных белковых комплексов
Глава 3. Повторная хроматография фракций, содержащих ДНКполимеразнуюи экзонуклеазнуюактивность, позволяет
обнаружить дополнительную активность АЭ.
Глава 4. Внутриклеточная активность экзонуклеаз в филогенезе. .
Заключение
Список литературы.
Список сокращений
АГсайт апуриновый или апиримидиновый участок ДНК, т.е. дезоксирибоза, лишенная азотистого основания ЛЭ автономные экзонуклеазы БСА бычий сывороточный альбумин ДАМФ дезоксиаденозинтрифосфат дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфат дАТФ дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ дезоксигуанозинтрифосфат дТТФ дезокситимидинтрифосфат дЦТФ дезоксицитидинтрифосфат МЭ 2меркаптоэтанол
ОНА отношение нуклеазных активностей отношение величины нулеазной активности, измеренной на 3меченной ДНК, к величине нуклеазной активности, измеренной на равномерно меченной ДНК ТМФ тимидинмонофосфат ТХУ трихлоруксусная кислота
ФМСФ фенилметилсульфонил фторид ингибитор сериновых протеаз ЭДТА этилендиаминтетраацетат ИЭМИ этилмалеимид
Введение.
АКТУАЛЬНОСТЬ


Некоторые из них способны образовывать комплексы с ДНКполимеразами и корректировать их ошибки. Анализ первичной структуры про и эукариотических экзонуклеаз, автономных и ковалентно связанных с ДНКполимеразами, показал, что экзонуклеазный центр имеет консервативную структуру, в которой выделяют три последовательности мотивы x I, x II, x III М. Т.С. I.V. Мотив x I имеет характерную структуру XX. Мотив x II VXXXX содержит консервативные остатки, участвующие в связывании трех последних нуклеотидов 3конца праймера в экзонуклеазном активном центре. ДНКполимераз семейства А, во всех ДНКполимеразах семейства Сив ДНКполимеразах семейства В это i других ДНКполимераз семейства В содержат остаток , остаток и 5 остаток Тгр, 4 два гидрофобных остатка, расположенных соответственно в четвертой и третьей позиции перед аспарагином, с них начинается мотив x II V М. Последовательность аминокислот мотива x III оказывается наиболее вариабельной, за исключением остатка глутаминовой кислоты. Структура его у субъединицы е ДНКполимеразы III Грамотрицательных бактерий, в экзонуклеазном домене ДНКполимеразы С Грамположительных бактерий, в РНКазе Т и у эукариотических АЭ X 1 и 2 представлена последовательностью XXX. Этот вариант называется Ехо Ше. Мотив x III большинства других экзонуклеаз, например ДНКполимеразы I . XXX. Остаток гистидина или тирозина непосредственно участвует в активации молекулы воды для нуклеофильной атаки на последнюю фосфоэфирную связь . М.Р. Аминокислотные остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот в консервативных мотивах отвечают за связывание двух ионов металла , необходимых для расщепления цепи ДНК. Замена этих остатков на аланин приводит к полной инактивации экзонуклеазной активности. На рисунке 1 представлена структура экзонуклеазного домена субъединицы г ДНКполимеразы III К i. Мутации, затрагивающие консервативные остатки экзонуклеазных мотивов, приводят к частичной или полной инактивации корректирующей функции фермента и снижению точности синтеза ДНК. Вернера, р, независимые автономные экзонуклеазы, например экзонуклеазы I, X . РНКазы РНКаза Т, РНКаза Д, олигорибонуклеаза . РНКазы 1, 2, 3, 4, полиАнуклеазы 2 и , компонент экзосомы 6 а также их гомологи из клеток человека, дрозофилы и других организмов . М.Р. Несмотря на то, что во всех этих ферментах есть экзонуклеазные консервативные последовательности, способность расщеплять 3конец ДНК показана не для всех ферментов. Так РНКазы, за исключением РНКазы Т, или вовсе не способны к гидролизу ДНК или проявляют очень слабую активность. Таким образом, обнаружение экзонуклеазных последовательностей в структуре гена ставит вопрос об исследовании специфичности экзонуклеазной активности продукта этого гена и о его функции в клетке. ДНКполимеразы и экзонуклеазы вирусов и бактериофагов. Многие эукариотические и бактериальные вирусы имеют гены, кодирующие ДНКполимеразу, а также другие ферменты, необходимые им для репликации своего генома. Если у такого вируса оказывается поврежденный ген ДНКполимеразы, то он оказывается неспособным к самостоятельной репродукции, и требует, например, присутствия в клетке родственного вируса с активной ДНКполимеразой. ДНКполимеразы многих вирусов обладают также экзонуклеазным активным центром, выполняющим корректорскую функцию. У этих организмов, повидимому, отсутствуют АЭ. Среди вирусных ДНКполимераз встречаются как самые точные ДНКполимеразы, например ДНКполимераза фага Т4, так и самые неточные ДНКполимеразы, как например обратная транскриптаза ретровирусов иммунодефицита человека. Наибольшей точностью обладают ДНКполимеразы, обладающие корректирующей 3г5 экзонуклеазой. Рис. А Структурная модель экзонуклеазного домена субъединицы ДНКполимеразы III . АЦГ. Б 3экзонуклеазный активный центр. Модель иллюстрирует взаимодействие тринуклеотида с ферментом. Один из ионов металла связывается консервативными остатками , 4 и 7 и взаимодействует с атомом кислорода субстрата. Второй ион металла связывается со вторым кислородным атомом боковой цепи глутамата и тремя молекулами воды.