Транспортная функция и ферментативные свойства мономерной мембраносвязанной формы Са2+ - АТФазы саркоплазматического ретикулума

• Автор: Щербакова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 c. : ил

Список сокращений
I. ВВЕДЕНИЕ б
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Структурная и функциональная характеристики
мембран саркоплазматического ретикулума
Глава II. Механизм трансформации энергии гидролиза
АТФ в транспорт Са^+
Глава III. Реконструкция Са - насоса
Глава ІУ. Структура молекулы АТФазы
Глава V. Структурная организация Са-завиеимой АТФазы
в мембране. Предполагаемые модели Са - насоса
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
111.1. Выделение фрагментов саркоплазматического
ретикулума из скелетных мышц кролика
111.2. Выделение Са -зависимой АТФазы
111.3. Выделение фосфолипидов из мембран саркоплазматического ретикулума
111.4. Электрофорез в полиакриламидном геле
111.5. Определение концентрации белка
111.6. Определение липидного фосфора
111.7. Электронный парамагнитный резонанс
111.8. Определение йН - групп белка
111.9. Определение АТФазной активности и Са - транспортирующей функции препаратов ретикулума
и АТФазы
111.10.Получение протеолипосом с различной концен-

трацией Са - АТФазы в мембране 2+
111.11. Обработка Са - АТФазы в реконструированных протеолипосомах бифункциональным сшивающим реагентом
I,3-дифтор-4,6-динитробензолом 2.
111.12. Обработка Са -АТФазы в реконструированных проте-олипосомах 5,5*-дитиобис-2-нитробензойной кислотой
111.13. Флуориметрическое определение Са -транспортирую щей функции с С1 -тетрациклином
111.14. Измерение триптофановой флуоресценции Са-АТФазы в реконструированных протеолипосомах
111.15. Электронномикроскопические исследования мембран24.
ных препаратов Са '’'-зависимой АТФазы

111.16. Получение липосом, нагаженных Са
111.17. Получение протеолипосом из делипидированной Са-АТФазы и различных фосфолипидов
111.18. Характеристика использованных реактивов
111.19. Статистическая обработка данных
1У. РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава I. Характеристика препаратов мембран саркоплазма-тического ретикулума и Са-зависимой АТФазы Глава II. Получение препарата мономерной мембраносвязанной формы Са-зависимой АТФазы
11.1. Получение протеолипосом с различной концентрацией белка в мембране
11.2. Зависимость термостабильности Са^+-АТФазы от ее концентрации в мембране
11.3. Исследование организации Са -АТФазы в мембранах реконструированных протеолипосом методом сшивающих реагентов

Глава III. Транспорт Са^+ реконструированными протеолипосомами
IIIЛ. Использование флуоресценции С1-тетрациклина для
оцентки концентрации ионов кальция внутри липосом
и протеолипосом
II 1.2. Реконструкция Са^-транспортирующей функции протеолипосом
III.3. Зависимость транспортной функции Са - АТФазы в реконструированных протеолипосомах от соотношения липид: белок
Глава IV. Исследование влияния разведения фосфолипидами на
некоторые ферментативные свойства Са -АТФазы
IV.1. Измерение удельной активности Са^+-АТФазы
1У.2. Зависимость числа оборотов Са -АТФазы от ее концентрации в мембране
1У.З. Зависимость АТФазной активности от концентрации
и^т2- ш
IV.4. Зависимость АТФазной активности от концентрации
ионов кальция ИЗ
Глава V. Температурозависимые структурные перестройки
Са^+-АТФазы в реконструированных протеолипосомах с различной концентрацией белка в мембране
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Глава I. Получение мономерной мембраносвязанной
формы Са^+- АТФазы
Глава II.Исследование ферментативных свойств мономерной мембраносвязанной формы Са^+- АТФазы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

большого молекулярного веса вне зависимости от температуры (25° и 4°). Но во всех случаях мономерная форма фермента сохранялась, и доминирующим было образование внутримолекулярных сшивок, то есть образование полимеров происходило за счет взаимодействия со сшивающим реагентом менее реакционоспособных групп (идентифицированы лизин, цистеин и тирозин).
р I
Было показано, что са^-транспортирувдая функция АТФазы ингибировалась уже в начальной стадии реакции, тогда как АТФазная активность изменялась значительно только при полной модификации
^ О ,
белка ДФДНБ. с а не защищал фермент от модификации. АТФ в концентрации 10 мМ приводила к некоторому снижению модификации (3,4 модифицированных группы белка против 4,7 в отсутствии АТФ). Соотношение форм АТФазы при этом существенно не изменялось
Таким образом, использование сшивающих реагентов для выяснения олигомерной организации АТФазы в мембранах СР не позволило дать какой-либо определенный ответ. Основные трудности в проведении таких экспериментов, по мнению ряда авторов, связаны с очень высокой концентрацией АТФазы в мембране (около 50 мг/мл), т.к. известно, что в водных растворах межмолекулярное сшивание альдолазы диметилсуберимидатом становится значительным уже при концентрации белка 5 мг/мл.
О |
Указанием на димерную организацию с а -АТФазы в мембранах СР рассматривались результаты экспериментов по ингибированию АТФазной активности флуоресцеинизотиоцианатом (144, 146, 147). Было показано, что полное ингибирование гидролиза АТФ мембранами СР происходит при включении одной молекулы ингибитора на две молекулы АТФазы. Однако при последующей более тщательной проверке было показано, что эти данные были ошибочными и включение флуоресцеинизотиоцианата происходит в соотношении моль ингибито-