BASP1 - белок головного мозга позвоночных, иммунологические свойства, локализация, секреция

• Автор: Плеханов, Антон Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ВАБР группа кислоторастворимых белков мозга

2.2. Идентификация белков группы ВАБР

2.3. Особые свойства белка ВАЗР1

2.4. Аминокислотный состав и первичная структура ВАБР1

2.5. Связь ВАБР1 с мембраной

2.6. Распределение ВАЗР1 в организме взрослом и эмбриональном

2.7. Субклеточная локализацияВАЗР1.

2.8. Участие белков группы ВАБР. вдхсте аксонов.
2.9. Участие белков ВАБР в процессах формирования памяти
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. МАТЕРИАЛЫ.
3.2. СТАНДАРТНЫЕ МЕТОДЫ.
3.2.1. Выделение белков группы ВАБР.
3.2.2. Выделение белков ВАБР с применением щлочи.
3.2.3. Аналитический электрофорез белков в ПААГ.
3.2.4. Окрашивание белковых зон в ПААГ ионами серебра
3.2.5. Препаративный электрофорез белков в ПААГ.
3.2.6. Получение иммунных сывороток.
3.2.7. Твердофазный иммуноферментный анализ.
3.2.8. Электроблоттинг.
3.2.9. Иммунохимическая процедура при иммуноблоттинге.
3.2 Выделение синаптосом и синаптосомальных мембран.
3.2 Экстракция липидов.
3.2 Тонкослойная хроматография липидов.
3.2 Анализ белковой составляющей липопротеидного комплекса, содержащего ВАБР1.
3.2 Фиксация мозга крысы перфузией и микротомия.
3.2 Иммуногистохимическая процедура.
3.2 Электрофоретический анализ перфузатов.
3.3. МЕТОДЫ, РАЗРАБОТАННЫЕ В ХОДЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.3.1. Выделение ВАБР с помощью хлороформа.
3.3.2. Модификация метода Фергюсона для определения молекулярных масс белков с аномальной электрофоретической подвижностью
3.3.3. Метод поверхностного иммуноблоттинга.
3.3.4. Электрофоретическое разделение липопротеидных комплексов в щелочных условиях.
3.3.5. Окрашивание липидов на тонкослойных хроматограммах амидочрным В и другими водорастворимыми красителями.
3.3.6. Обнаружение антигенов в разбавленных растворах.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Видоспецифичность антител против ВАБР1.
4.2. Иммуногистохимическое исследование распределения ВАБР1 сравнительно с САР в головном мозге крысы.
4.3. Синаптосомальный мембранный липопротеидный комплекс, содержащий ВАЗР1.
4.4. Анализ перфузатов, собранных в процессе электрофизиологи ческих экспериментов с обонятельной коры мозга крысы.
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. Иммунологические свойства ВАБР1.
5.2. Локализация ВАБР1 и САР в мозге крысы.
5.3. Возможное ближайшее мембранное окружение ВАБР1
в нервных окончаниях.
5.4. Секреция ВАБР и других белков клетками мозга
в различных функциональных состояниях
5.5. Заключение ИЗ
6. ВЫВОДЫ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
8. ПРИЛОЖЕНИЕ Программа для вычисления уравнения линейной
регрессии по методу наименьших квадратов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДД длительная посттетаническая депрессия
ДДСИа додецилсульфат натрия
ДП длительная посттетаническая потенциация
кДа килодальтон
ПААГ полиакриламидный гель
ПК С протеинкиназа С
трис трисоксиметиламинометан
ТСХ тонкослойная хроматография тонкослойная хроматограмма ТХУ трихлоруксусная кислота
ФБР физиологический буферный раствор О,М 1, 0,М
К,НаР,
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
РМББ фенилметилсульфонилфторид.
Аминокислоты
Ала А аланин Лей Ь лейцин
Арг Ю аргинин Лиз К лизин
АСН Ю аспарагин Мет М метионин
Асп В аспарагиновая кислота Про Р пролин
Вал V валин Сер Б серик
Гис Н гистидин Тир У тирозин
Гли С глицин Тре Т треонин
Глн 0 глутамин Три триптофан
Глу Е глутаминовая кислота Фен Г фенилаланин
Иле I изолейцин Цис С цистеин
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Настоящая работа является составной частью исследований механизмов синаптической передачи и формирования памяти, поскольку посвящена исследованию мажорного синаптического белка ВАБР1, в частности, его участия в феноменах синаптической пластичности. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение белка ВАЗР1 в связи с поиском его биохимической функции исследование его распределения в мозге на органном, клеточном и надмолекулярном уровнях и изучение возможного участия ВАБР1 в формировании ДПДД и других функциональных состояний нервных клеток. ВА8Р1 в мембране. ВАБР и других белков клетками мозга в различных функциональных состояниях в частности, в состоянии ДП. Научная новизна и пуахшческая значимость уаботы. Впервые исследовано распределение 1 в мозге взрослой крысы. Впервые продемонстрирована иммунологическая видоспецифичность белков семейства 1. Впервые показано, что нервные клетки в различных функциональных состояниях секретируют 1 а также белки . Проведенные исследования носят фундаментальный характер, поскольку способствуют выяснению молекулярных процесов, происходящих в синаптической области и лежащих в основе обучения, формирования следа памяти и некоторых других подобных функциональных состояний нервной системы. В ходе исследований разработаны усовершенствованные методы иммуноблоттинга, окрашивания липидов на ТСХ, определения молекулярной массы белков, поиска антигенов в разбавленных растворах, электрофоретического разделения липопротеидных комплексов. Использование бензкдина в качестве хромогена для иммунопероксидазной реакции и цельного молока не при иммуноблоттинге также являются авторскими разработками. Предложенные методы могут найти широкое применение в лабораторной практике. Апуобаиия уаботы. Материалы диссертации были отмечены премией Российского Биохимического общества за г. Исследования соискателя по теме диссертации поддержаны персональными грантами г. СанктПетербурга , , г. Французского правительства г. Государственной научной стипендией РФ для молодых учных Г. XV, XVI съездах Международного нейрохимического общества на X,
XI. XII съездах Европейского нейрохимического общества на XVII Международном съезде по биохимии и молекулярной биологии. Публикации. По теме диссертации опубликовано работ. В ходе исследований белков высокоподвижной группы , в мозге различных позвоночных была обнаружена новая группа белков, названная нами от англ. Мосевицкий и др. Методы, разработанные для выделения и изучения белков , , оказались в основном применимы и для исследования новой группы белков, хотя во многих отношениях эти белки отличались от . Группа состоит из четырх белков 1, , и 3. Эти белки обнаружены в мозге всех исследованных видов млекопитающих и птиц курица, мышь, крыса, кролик, корова, свинья, кошка, человек. Да. Растворимостью в 5ной хлорной кислоте, высоким содержанием заряженных аминокислотных остатков и молекулярной массой эти белки напоминают хорошо изученные белки высокоподвижной группы , . В отличие от белков основных белков, присутствующих как в ядре, так и в цитоплазме vi . При этом 1, и 3 оказались связанными с мембранными структурами, 2
оказался цитозольным белком. Исследование внутриклеточного распределения белков выявило, что они, в частности, представлены в большом количестве в аксонных окончаниях синаптосомах и конусах роста аксонов. Это позволяло предполагать участие этих белков в механизмах синаптической передачи и формирования памяти. Следующим необходимым шагом в исследовании новой группы белков, очевидно, являлась идентификация белков В с известными белками синаптической области. Этой задаче была посвящена диссертация Г. Ю.Складчиковой . При сравнении с ранее описанными белками было обнаружено сходство вновь обнаруженных белков с нейронным белком , i, , , , известным также как В i . I vi . И действительно, иммунохимический анализ и пептидное картирование показали , что и являются двумя формами мембранной и цитозольной белка Мосевицкий и др. Складчикова,. Белок достаточно хорошо исследован, и исследования его продолжаются до настоящего времени см. Это кислый 4,6 i .