α-субъединица комплекса COP I дрожжей Hansenula polymorpha: структурно-функциональная организация и роль в гомеостазе кальция

• Автор: Чеченова, Мария Барасбиевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ТРАНСПОРТ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ.

1. Организация путей секреции в клетках дрожжей

2. Транспортные везикулы.

2.1 СОРИ везикулы.

2.1.1 Структура комплекса СОРИ

2.1.2 Сортировка белков в СОРИ везикулы.

2.2 СОР1 везикулы

2.2.1 Структура комплекса СОР1

2.2.2 Участие СОР1 везикул в прямом транспорте между эидоплазматическим
ретикулумом и аппаратом Гольджи
2.2.3 Участие СОР1 везикул в обратном транспорте между
эидоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи.
2.2.2.1 Транспорт белков, содержащих днлизиновый сигнал.
2.2.2.2 Транспорт белков, содержащих сигнал КЛ ЮЕЬ и белка 8еср.
2.2.3 Модели СОР1зависимого транспорта между эидоплазматическим
ретикулумом и аппаратом Гольджи
2.3 Клатриновыс везикулы
3. Транспорт между цистернами аппарата Гольджи.
3.1 Структура аппарата Гольджи
3.2 Модели транспорта белков между цистернами аппарата Гольджи
4. Слияние мембран.
4.1 Молекулы
4.2 Регуляция сборки комплекса
4.2.1 бслки семейство белков 8.
4.2.2 Белок 8р.
4.3 Система связывающих белков
5 Роль ионов кальция в секреторных путях
5.1 Кальциевые помпы
5.2.1 Кальциевые помпы дрожжей
5.3 Ответ клетки на снижение Са2 в секреторных пугях.
Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Плазмиды и штаммы микроорганизмов.
1.1 Плазмиды, использованные в работе.
1.1.1 Плазмиды, полученные в данной работе
1.2 Штаммы микроорганизмов
1.2.1 Штаммы дрожжей
1.2.2 Штаммы бактерий.
2. Условия культивирования и генетические методы.
3. Гспионнжспсрные манипуляции и полимеразная цепная реакция
4. Выделение и анализ ДНК клеток II.
5. Выделение и анализ РНК клеток II.
6. Анализ секреторных белков дрожжей.
6.1 Анализ белка в клетках II. и . vii.
6.2 Получение антител и анализ белка в клетках Я.
6.3 Определение ферментативной активности и количества иРА
6.4 Зимография инвертазы
6.5 Анализ секретированной хитиназы.
7. Иммуноблотгинг белков.
Э. Флуоресцентная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Клонирование и секвенированне гечаЯЕТ Н. ро1утогра.
2. Деления Зкоицевой части кодирующей области гена НрЯЕТ1 не детальна
для клеток дрожжей.
3. Ген ИрЯЕТ II. ро1утогр1ш является жизненно важным
4. Дефект аСОР приводит к секреции неправильно сврнутых форм
урокнназы
5. аСОР II. ро1утогр1ш участвует в транспорте СРГзаякорсииого белка
6. Функциональное взаимодействие между аСОР и Ртг1р II. ро1упюгр1ш
6.1 Свсрхэкспрессия НрРМЯ супрессирует фенотипические проявления
мутации га 1
6.2 Мутация в гене НрЯЕТ приводит к снижению количества белка Ртг1р и
нарушению его распределения в клетках Н. ро1ушогр1ш
6.3 Мутация га 1 не приводит к нарушению гликозилирования
секрстнрусмых белков.
6.4 Летальность сочетания мутации га с делецией гена НрРМЯ.
7. Идентификация генов II. ро1упюгрш, в мультикопнйпом состоянии
супрессирующих мутантные проявления га1.
8. Изучение влияния свсрхэкспрсссии гена 8Е на фенотипические
проявления мутаций га 1 и Лртг1.
9. Делсция гена НрБЕБ приводит к нарушению морфологии вакуолей в
клетках II. ро1утогрш.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. аСОР дрожжей Н. ро1утогра структурные особенности и роль в
поддержании гомеостаза кальция.
1.1 Мутации, затрагивающие Сконцевую область белка аСОР у сегетде
и Н. ро1утогрш, приводят к различным фенотипическим проявлениям
1.2 Дефект аСОР Н. ро1утогрт приводит к нарушению обратного транспорта
белков из Гольджи в эндоплазматический рстикулум
1.3 Функциональное взаимодействие белков ЯеПр и Ргпг1р Н. ро1утогрЬа
2. Белок II. р1утогра Нр5ез1р возможная роль в клетке.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Первая стадия инициируется цитозольными белковыми комплексами, окаймляющими эти везикулы x окаймляющие комплексы, которые связываются с донорской мембраной, участвуют в формировании и отпочковывании везикул, а также в сортировке переносимых молекул, и диссоциируют при слиянии везикулы с мембраноймишенью. Сейчас хороню охарактеризованы три основных типа транспортных везикул, и они описаны как в клетках высших эукариот, так и у дрожжей. Первыми были описаны клатриновые везикулы в клетках млекопитающих, образующиеся за счет клатринового комплекса и осуществляющие эндоцитоз и транспорт белков из Гольджисети , ivv к эидосомам , i, . Другой тип везикул, формирующихся с помощью цитозольного белкового комплекса I, был также впервые открыт в клетках млекопитающих. Было показано, что эти везикулы отпочковываются от цистерн Гольджи и направляют белки к клеточной поверхности i . Однако до конца роль СОР1 везикул не исследована. Благодаря генетическим исследованиям, выполненным при использовании клеток дрожжей, точно известно, что эти везикулы осуществляют обратный транспорт белков из Гольджи в эндоплазматический рстикулум ЭР, тогда как их участие на других этапах транспорта в секреторных путях остатся спорным. Третий тип везикул формируется за счт белков комплекса СОРИ и осуществляет транспорт белков из ЭР в Гольджи. Эти везикулы были впервые охарактеризованы в клетках дрожжей . Процесс слияния мембран везикул и секреторных органелл также является немаловажным в жизнедеятельности клетки. Его можно разделить на несколько этапов инициирующий этап ii, этап связывания i и стыковка i мембран с последующим объединением липидного бислоя и содержимого везикул. Многие компоненты, участвующие в этом процессе, уже идентифицированы как в клетках млекопитающих, так и у дрожжей 8, 7, молекулы , связывающие комплексы, ГТФазы и т. Помимо белковых компонентов, немаловажную роль в везикулярном транспорте играют ионы кальция. Гомеостаз Са2 поддерживается в клетке за счт транспорта его из окружающей среды и высвобождения из внутриклеточных депо, аккумулирующих ноны Са2 в ответ на различные физиологические сигналы. Поддержание постоянного внутриклеточного уровня Са2 необходимо для процессов транспорта из ЭР в Гольджи , . Гольджи i . Ионы 2 играют важную роль в процессе слияния мембран на всех этих этапах. Данная работа посвящена изучению функционирования асубьсдиницы окаймляющего комплекса I в клетках дрожжей . Впервые был охарактеризован ген ортолог гена 1 . Изучение мутанта позволило предположить существование взаимосвязи между везикулярным транспортом и гомеостазом кальция в секреторных путях. Организация путей секреции в клетках дрожжей. В клетках всех эукариот, в том числе и дрожжей, секреторные белки синтезируются па мембранах шероховатого ЭР, траислоцируюгся в люмен ЭР за счт своей сигнальной последовательности, где претерпевают ряд изменений, способствующих их дальнейшему созреванию. В ЭР происходят начальные этапы гликозилнрования белков, формирование правильной конформации, опознание неправильно сврнутых молекул и направление их па деградацию. Белки, прошедшие все этапы отбора сортируется и направляются в аппарат Гольджи в составе транспортных пузырьков Рисунок 1. Мембраны шероховатого ЭР, расположенные рядом с iмскомпартмеитами стопки Гольджи имеют свободные от рибосом участки выпячивания мембраны , , . Эти области, называемые переходными элементами ЭР , ii , представляют собой сайты выхода из ЭР. Процесс отпочковывания от происходит за счт сборки цитозольного окаймляющего комплекса СОРИ . В клетках млекопитающих после выхода из ЭР СОРИ везикулы быстро избавляются от окаймляющего комплекса и сливаются друг с другом или с мембранами везикулярнотубулярных кластеров V, vi , называемых также промежуточным компартмсигом I, i ii i . V состоят из групп везикул и взаимосвязанных тубулярных структур, которые расположены в непосредственной близости от . Элементы промежуточного компартмента транспортируются по микротрубочкам к Гольджи, где формируют iГольджи сеть i, i .