Изучение гена D-глюкуронил C5-эпимеразы как возможного гена-супрессора опухолевого роста

• Автор: Прудникова, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Протсопгаканы.

1.1.1. Строение и классификация глнкозаминогликанов

1.1.2. Локализация и функции иротеогликанов.

1.1.3. Состав иротеогликанов в трансформированных клетках.

1.1.4. Биосинтез иротеогликанов.

1.2. глюкуронил С5эпимераза.

1.2.1. Субстратная специфичность глюкуронил С5эпимеразы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.2. Методы
2.2.1. Выделение РНК
2.2.2. Обратная транскрипция
2.2.3. Анализ экспрессии генов методом мультиплексной ОТГ1ЦР.
2.2.4. Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.2.5. Количественная ПЦР в реальном времени
2.2.6. Вестернблот анализ
2.2.7. Иммуногистохимия.
2.2.8. Клонирование.
2.2.9. Трансфекция и отбор клонов, стабильно экспрессирующих эпимерату
2.2 Определение клеточной пролиферации i vi.
2.2 Определение влияния глюкуроиил С5эпимеразы на рост экспериментальных опухолей i viv.
2.2 Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Экспрессия глюкуронил С5эпимеразы
3.1.1. Экспрессия глюкуронил С5энимеразы в различных тканях человека
3.1.2. Подбор условий ПЦР с различными праймерами для изучения экнрессии глюкуронил С5эпимеразы
3.1.3. Анализ экспрессии гена глюкуронил С5эгшмеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека методом мультиплексной ОТПЦР
3.1.4. Анализ экспрессии гена глюкуронил С5эпимеразы в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека метолом количественной ПЦР в реальном времени
3.1.5. Анализ экспрессии глюкуронил С5эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы методом мультиплексной ОТПЦР и количественной ПЦР в реальном времени.
3.1.6. Определение присутствия белка глюкуронил С5эпимеразы в тканях молочной железы человека методом Вестсрнблота.
3.1.7. Анализ экспрессии гена глюкурнил С5эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека.
3.2. Генин активирующий тест I Iivi .
3.2.1. Клонирование гена глюкуронил С5энимсразы
3.2.2. Влияние экспрессии глюкуронил С5эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов.
3.2.3. Изучение влияния экспрессии гена глюкуронил С5эпимеразы на рост экспериментальных опухолей ш viv
3.2.4. Анализ экспериментальных опухолей
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Влияние экспрессии глюкуронил С5эпимеразы на рост стабильно трансфицированных клонов. Глава 4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. В настоящее время открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. К таким молекулам относятся и протеогликаны ПГ сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и присоединнных к ним цепей гликозаминогликанов ГАГ. Протеогликаны находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе ВКМ, выполняя разнообразные функции, в том числе связанные с участием в межклеточных взаимодействиях и во взаимодействиях клетки с ВКМ за счет связывания с различными компонентами ВКМ, включая факторы роста и их рецепторы i . Изменения экспрессии или локализации этих молекул, так же как и ферментов, вовлеченных в их биосинтез и деградацию, ассоциированы с измениями пролиферативной активности клеток i . Известно, что при злокачественной трансформации меняется структура, состав, степень сульфатироваиия i . I i . V . Содержание остатков идуроновой кислоты в составе нротеогликанов ПГ имеет важное значение для нормального функционирования гепарансульфат протеогликанов ГСПГ . Показано, что содержание идуронового компонента коррелирует с антипролиферативным эффектом гепарансульфат протеогликанов ГС, богатые остат ками идуроновой кислота I оказывали значительный антипролиферагивный эффект на клетки мезотелиомы, тогда как ГС, имеющие в своем составе в основном остатки глюкуроновой кислоты, не имели подобного эффекта . При опухолях прямой кишки . ГАГ версикана и декорина снижается. Изменения в структуре и соотношении I в опухоли могут свидетельствовать о том,
что, возможно, при злокачественной трансформации происходит нарушение в процессе биосинтеза ПГ, в частости в процессе эпимеризации. С5эпимераза является одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов. Этот фермент проводит реакцию эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую в углеводных цепях ГСПГ, участвующих в поддержании межклеточного контакта и передаче сигнальной информации. Эпимераза является единственным ферментом биосинтеза ГСПГ, о котором практически ничего не известно. До настоящего времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза ПГ определена ее субстратная специфичность, кинетические свойства i . ДНК эпимеразы из легкого быка i . Разрушение гена, кодирующего глкжуронил С5эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбрионов, у которых были обнаружены дефекты развития почек, легких, нарушения в костной ткани i . Эти данные свидетельствуют о том, что экспрсссияакивность эпимеразы может иметь важное значение для правильного формирования органов. Отсутствие других данных о глюкуронил С5эпимеразе не позволяет получить представление о том, есть ли какаялибо тканеспецифичность в экспрессии глюкуронил С5эпимсразы у человека, изменяется ли экспрессияактивность этого фермента при злокачественной трансформации и существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением эксирсссииактивности глюкуронил С5эпимеразы. Нами была высказана гипотеза, что при злокачественной трансформации клеток происходит нарушение экспрессии либо активности глюкуронил С5эпимеразы, что приводит к изменению структуры и состава ГСПГ и пролиферативной активности клеток. Цель данной работы исследовать роль глюкуронил С5эпимеразы в регуляции клеточной пролиферации и злокачественной трансформации. Определить уровень экспрессии гена глюкуронил С5эпимеразы в различных тканях человека. Исследовать экспрессию глюкуронил С5эпимеразы в клинических образцах злокачественных и доброкачественных опухолей и культурах опухолевых клеток рака легкого, молочной и нредегательной желез человека. Изучить влияние экспрессии гена глюкуронил С5эпимеразы на пролиферативную активность опухолевых клеток карциномы молочной железы 7, карциномы предстательной железы и мелкоклеточного рака легкого i vi. Изучить влияние глюкуронил С5эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей i viv мыши I и провести анализ се экспрессии в выросших опухолях. С5эпимсразы по сравнению с нормальной тканыо.