Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств

• Автор: Рябченко, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Спирохеты i i как возбудитель иксодового клещевого боррелиоза ИКБ

1.1.1. История открытия возбудителя ИКБ.

1.1.2. Эпидемиология иксодового клещевого боррелиоза

1.1.2.1. Географическое распространение возбудителя ИКБ

1.1.2.2. Пути передачи i i

1.1.3 Патогенез и клиника ИКБ.

1.1.4. Механизмы уклонения спирохет i i

от иммунной системы хозяина.
1.2. Морфологические и генетические особенности спирохет комплекса i i
1.3. Антигены спирохе т комплекса i i
1.3.1. Семейство внешних поверхностных протеинов
1.3.2. Декоринсвязывающие белки
1.3.3. Флагеллярныс белки .
1.3.4. Белок Р
1.3.5. Белок Р
1.3.6. Семейство основных мембранных белков Вмр.
1.3.7. Белок Р
1.4. Диагностика ИКБ.
1.4.1. Обнаружение спирохет i i в биологических образцах методом культивирования на питательных средах.
1.4.2. ДНКдиагностика ИКБ
1.4.3. Серодиагностика ИКБ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы
2.2. Методы работы с ДНК
2.2.1. Получение суммарного препарата ДНК из клещей.
2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из культур боррелий.
2.2.3. Выделение плазмидной Д1I из .i.
2.2.4. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний .i
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях
2.2.6. Выделение ДНК из агарозного гелт методом сорбции на мелкодисперсном оксиде кремния Силика
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНКлигазы бактериофага Т4
2.2.9. Амплификация ДНК в системе ПЦР
2.3. Методы работы с бактериями.
2.3.1. Используемые среды и общие приемы.
2.3.2. Изоляция спирохет В.i из клещей
2.3.3. Изоляция спирохет В.i с помощью заражения мышей
2.3.4. Обнаружение ДНК боррелий в культуре и генотипирование изолятов с помощью ПЦР.
2.3.5. Обнаружение ДНК боррелий в клещах и генотипирование изолятов с помощью ПЦР.
2.3.6. Трансформация компетентных клеток .i
2.4. Индукция экспрессии клонированных генов боррелий в клетках .i
2.4.1. Индукция экспрессии генов, клонированных в составе вектора , либо в его производных.
2.5. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ.
2.6. Очистка рекомбинантных белков аффинной хроматографией на никельхелатном сорбенте
2.7. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков боррелий
2.7.1. Используемые сыворотки
2.7.2. Тврдофазный иммуноферментный анализ
2.8. Определение первичной структуры фрагментов ДНК, сравнение
аминокислотных последовательностей
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Получение изолятов i i и определение их геновидовой принадлежности
3.1.1. Культивирование спирохет i i , выделенных из клещей
3.1.2. Культивирование спирохет i i с помощью заражения лабораторных мышей
3.2. Оценка зараженности клещей Ix, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами
В.i
3.3. Конструирование векторов для экспрессии рекомбинантных
белков клетках .i.
3.3.1. Клонирование гена в .i в составе вектора
3.3.2. Конструирование плазмиды 3
3.3.3. Конструирование плазмиды .
3.3.4. Конструирование вектора 3.
3.4. Выбор генов спирохет i i для клонирования в .i в составе экспрессирующих векторов.
3.5. Амплификация кодирующих областей генов , ,,
и .iii7 и .ii, подготовка к клонированию
3.6. Клонирование генов и в составе вектора 3.
3.7. Модификация коммерческого вектора рЕТЬ.
3.8. Клонирование кодирующих областей генов1аА,1аВ и ВЬрВ в составе вектора рЕТгп
3.9. Переклонирование кодирующих областей генов охр А, оярС и 1аА
в составе вектора рЕТт.
3 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков РИА, Р1аВ, ИЬрВ, ОэрА, ОэрС Вагтп группы 7т и ОзрС В.сфсеШ.
. Сравнительный анализ последовательностей антигена Р1аА.
. Сравнительный анализ последовательностей антигена Р1аВ.
. Сравнительный анализ последовательностей антигена ЕЬрВ
. Сравнительный анализ последовательное гей антигена ОьрА
. Сравнительный анализ последовательностей антигена ОярС
В.агеШ изолят ИБК
Сравнительный анализ послсдовастльностей антигена ОэрС Ваппп группа изолят ЫБК.
3 Получение и очистка рекомбинантных белков
3 Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков в ИФА с сыворотками больных иксодовым клещевым боррелиозом
. Определение оптимальной концентрации антигена.
. Анализ иммунореактивности рекомбинантных антигенов боррелий в ИФА с сыворотками больных ИКБ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать, значительное отличие антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. Можно предположить, что такие отличия аминокислотных последовательностей антигенов будут обусловливать и их иммунохимические свойства. Вес эти причины сдерживают развитие работ по созданию высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики иксодового клещевого боррелиоза, что, в свою очередь, остается важной задачей здравоохранения. Цель работы получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов В. Оценить зараженность клещей Ix i , населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет В. Получить культуры западносибирских изолятов В. На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет В. ИКБ. Сконструировать экспрессирующие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках . Клонировать кодирующие области генов выбранных иммунодоминантных белков . Определить нуклеотидные последовательности клонированных генов спирохет В. Получить очищенные рекомбинантные белки западносибирских изолятов В. ИФА на сыворотках больных ИКБ. Оценить пригодность каждого из рекомбинантных антигенов боррелий для серодиагностики локализованной и диссеминированной стадий ИКБ. В.i Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей . Установлено, что только два геновида боррслий циркулировали до г. В и г. В. i. Сконструированы оригинальные бактериальные экспрессирующие вектора и 3, содержащие химерные регуляторные районы, полилинкер для клонирования генов и участки, кодирующие олигогистидиновые последовательности в Сконцевой области рекомбинантных белков. Штаммы . Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов , , , и западносибирского изолята . Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации под инвентарными номерами . На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов , , , и спирохет В. Европе. Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков ПаЛ, , , и методом ИФА в экспериментах с сыворотками от больных ИКБ и здоровых доноров. Продемонстрирована перспективность использования названных рекомбинантных белков для серодиагностики ИКБ. Предложена комбинация рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителям ИКБ в крови больных, как с локализованной, так и с диссеминированной стадиями заболевания. Полученные в настоящей работе данные о зараженности клещей Ix отловленных в рекреационной зоне ННЦ в , , и годах, различными геновидами спирохет В. ИКБ и возможных клинических проявлений заболеваний. Создана музейная коллекция западносибирских изолятов . Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята . Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач. Сконструированы векторы и 3 пригодные для клонирования и эффективной индуцируемой экспрессии генов в клетках . Штаммы . Сконструированные штаммы . Разработана технология получения рекомбинантных белков В. ЕТт в клетках . Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены , , , и могут быть использованы в серодиагностике ИКБ, вызываемого спирохетами В. России. В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с по г. Ix циркулировали только три геновида боррелий . Заражнность иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, . Западносибирский изолят . Европы. Сконструированные плазмидные векторы , 3 и модифицированный в настоящей работе вектор рЕТЬ рЕТт являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках Е. Штамм . По результатам исследований антигенных свойств рекомбинантных белков , , , и , данные белки могут быть рекомендованы для серодиагностики ИКБ.