Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм

• Автор: Кулуев, Булат Разяпович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Каулимовирусы и их полногеномные промоторы.

1.1.1. Классификация растительных параретровирусов.

1.1.2. Растенияхозяева, симптоматика вирусных заболеваний, распространение каулимовирусов.

1.1.3. Способы передачи вирусной инфекции

1.1.4. Структура и воспроизведение генома каулимовирусов на примере вируса мозаики цветной капусты.

1.1.5. Биосинтез белков и функции белков каулимовирусов.

1.1.6. Строение геномов, открытых рамок считывания и белковые продукты каулимовирусов

1.1.7. Полногеномные промоторы каулимовирусов.

1.2. Методы направленной искусственной эволюции генов i vi

1.2.1. ДНК шаффлинг
1.2.2. Другие методы, основанные на рекомбинации
1.2.3. Применение ДНК шаффлинга.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Краткая характеристика объектов исследований.
2.2. Выделение и очистка тотальной ДНК растений и каулимовирусов.
2.3. Выделение и очистка илазмидной ДНК.
2.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
2.5. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.
2.6. Препаративный гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих
условиях
2.7. Элюция ДНК из агарозных гелей
2.8. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭцеллюлозой.
2.9. Полимеразная цепная реакция
2 Клонирование промоторных участков каулимовирусов
2 Подготовка компетентных клеток
2 Трансформация компетентных клеток .i плазмидной ДНК.
2 Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом.
2 Подготовка электрокомпетентных клеток .i и .i.
2 Электропорация компетентных клеток .i и .i
2 Приготовление протопластов из листьев табака
2 Трансформация протопластов табака методом химически индуцированного эндоцитоза
2 Агробактериальная трансформация листовых дисков табака
2 Получение одноцепочечной ДНК с помощью ДНКполимеразы фага i
2 ДНК шаффлинг
2 Выделение тотального белка из растений
2 Флюориметрическое определение активности в клеточных экстрактах
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Бактериальные штаммы и фагмидные вектора
2 Реактивы и материалы
2 Составы использованных стандартных растворов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов каулимовирусов
3.1.1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов.
3.1.2. Поиск промоторных последовательностей и консервативных участков ДНК, фланкирующих промоторные области.
3.2. Поиск инфицированных каулимовирусами растений на территории Уфы и окрестностей
3.3. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина.
3.4. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики
3.5. Секвенирование промотора вируса мозаики георгина и анализ нуклеотидной последовательности
3.6. Секвенирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики и анализ нуклеотидной последовательности.
3.7. Модификация вектора i и клонирование промоторов ВМГ и ВКГГ в векторы i , i I1, i .
3.8. Получение промоторов каулимовирусов в одноцепочечной форме при помощи ДНКполимеразы фага i
3.9. Конструирование химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга.
3 Анализ экспрессионной активности генов и под управлением химерных и природных форм промоторов каулимовирусов в клетках .i, .i и .
3 Сравнительный анализ экспрессионной активности гена под управлением промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ в трансгенных растениях табака
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга. Впервые проведен анализ эксирессионной активности промоторов вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 0 пн. Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого молчания трансгена. Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков. Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов Москва, на международной конференции Генетика в России и мире Москва, на Российской школесеминаре Генетика микроорганизмов и биотехнология Москва ПущинонаОке, на Четвертом съезде общества биотехнологов России Пущино, , на Школесеминаре молодых ученых Биомика наука XXI века Уфа, . Публикации. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 2 страницах, содержит 3 таблицы и рисунка. Состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка литературы, включающего 3 источника. Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИАгидель 4, грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ НШ4 и НШ4. Каулимовирусы это растительные вирусы, инфицирующие высшие растения и относящиеся к группе растительных параретровирусов, родственные ретровирусам. К супергруппе параретровирусов относят две большие группы вирусов, одни поражают представителей высших растений и относятся к семейству ivii, другие поражают представителей позвоночных и относятся х семейству vii . Параретровирусы в отличие от ретровирусов в качестве генома содержат ДНК, а не РНК, к тому же ДНК ретровирусов часто интегрирована с ДНК хозяина, а ДНК параретровирусов ведет себя как свободная хромосома в ядрах большинства клеток. Объединяет их то, что геном и тех и других проходит через стадию обратной транскрипции. Но у параретровирусов из прегеномной РНК образуется геномная ДНК, а у ретровирусов при этом из геномной РНК образуется прегеномная ДНК, которая интегрируется с геномом хозяина. Но все же ряд функциональных и структурных особенностей показывает, что параретровирусы и ретровирусы филогенетически связаны , . Все известные ныне растительные иараретровирусы относятся к семейству ivii. Семейство ivii делят на две большие группы каулимовирусы и баднавирусы, которые возводят в ранг родов ivi и vi . Наиболее типичным и изученным представителем каулимовирусов является вирус мозаики цветной капусты ВМЦК . ДНК размерами от до пар нуклеотидов . Кроме вируса мозаики цветной капусты, к каулимовирусам относят вирус кольцевой гравировки гвоздики ВКГГ , . ВМН ii . ВМНК , ii, , вирус, окаймляющий жилки земляники ВОЖЗ vv . ВМГ Богунов, Черкасский, ii, , вирус бледной пятнистости сои . V . Представители рода vi могут инфицировать как однодольные, так и двудольные растения, их частицы имеют палочковидную форму, они могут передаваться различными видами насекомых . К баднавирусам относятся палочковидный вирус риса Нау . Капо . Также описаны растительные параретровирусы, принадлежность которых к тому или иному роду не определена.