Роль структуры ростового домена урокиназы во взаимодействии с урокиназным рецептором uPAR/CD87

• Автор: Белоглазова, Ирина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Урокнназа.

1.1. Структура урокиназы.

1.2. Структура доменов урокиназы.

2. Взаимодействие с рецептором.

2.1. Структура урокиназного рецептора

2.2. Комплекс АКФ УКР.

3. Урокиназа и гепарин.
4. Ограниченный нротсолиз урокиназы
5. Посттранеляционные модификации урокиназы
6. Регуляция экспрессии урокиназы.
7. Ингибирование урокиназы ПАИ1, ПАИ2, РЧ1
8. Эндоцнтоз урокиназы.
9. Витронектин.
. Интегринм
. Функции урокиназы
.1. Протеолитическая функция комплекса УК УКР
.2. Адгезия и миграция.
.2.1. Протеолиз
.2.2. Кринглзависимая миграция
.2.3. Разрушение фокальных контактов.
.2.4. Сигналинг через вРСЯ.
.2.5. Витронектин
.2.6.1ЛЬопосредованная миграция
.3. Пролиферация.
.4. Апоптоз
. Участие урокиназы в ремоделировании тканей.
.1. Рестеноз.
.2. Ангиогенез.
.3. Рост и метасгазирование опухолей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Химические реактивы.
2. Антитела
3. Культуральные среды и пластик.
4. Очистка рекомбинантных форм белков
5. Определение концентрации белка в пробах.
6. ДСНэлектрофорез
7. Изучение растворимости телец включения в гуанидине
8. Очистка ростового домена
9. Изменение флуоресценции Тгр при температурной денатурации белка
. Круговой дихроизм
. Флуроресценция белков, ме,ченых с помощью Флуоресцеин5малеимид ..
. Иммобилизация белков.
. Получение общего клеточного лизата.
. Иммуноблоттинг.
. Иммуноферментный анализ
. М9 среда.
I С 1Т
. Получение и очистка белка с изотопным замещением и С.
. Очистка комплекса УК УКР.
. Спектроскопия ЯМР
. Клеточные культуры.
. Получение белков из эукариотических клеток.
. Связывание йодированных рекомбинантных форм урокиназы человека с клетками
. Миграция клеток.
. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Очистка рекомбинантных форм урокиназы человека.
2. Очистка ростового домена урокиназы.
3. Изучение вторичной структуры РД, КД, АКФ.
4. Изучение наличия неспаренных цистеинов в ростовом домене.
5. Изучение функциональности крингл и ростового доменов рекомбинантных форм урокиназы.
5.1. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором на поверхности клеток СНО
5.2. Хемотактическое действие рекомбинантных форм урокиназы на миграцию гладкомышечных клеток человека.
5.3. Взаимодействие рекомбинантных форм урокиназы с урокиназным рецептором из клеток 7
5.4. Сравнение рекомбинантных форм урокиназы, полученных в Е.СоП с формами урокиназы , экспрессируемыми в эукариотических клетках
6.1. Подбор условий для ЯМР.
6.1.1. Подбор среды.
6.1.2. Подбор условий роста Е. соН в среде Бтагйез
6.1.3. Подбор условий очистки белка.
6.2. Получение комплекса АКФС0 УКР в максимально возможной концентрации
6.2.1. Очистка комплекса АКФ СО УКР
6.2.2. Определение стехиометрии связывания УКР с АКФСЛЭ.
6.2.3. Повышение концентрации комплекса АКФС0 УКР
6.2.4. Подбор буфера для ЯМР
6.3. Приготовление образцов для ЯМР
6.3.1. Урокиназный.рецептор
6.3.2. АКФ СО.
6.3.3. Смесь АКФС0УКР
6.3.4. Стабильность белков и комплекса.
6.4. Спектры ЯМР.
6.4.1. Отнесение Н, С и ,5Ы химических сдвигов рекомбинантного
АКФ СО
6.4.2. Конформация рекомбинантного фрагмента урокиназы в свободном состоянии и в комплексе с рецептором.
ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Недавно был расшифрован кристалл комплекса урокиназного рецептора и аминоконцевого фрагмента урокиназы АКФ, лишенной протеолитического домена . Как было показано, при взаимодействии с урокиназой первый и третий домены рецептора сближаются таким образом, что рецептор смыкается в кольцо, образованное тремя доменами. При этом происходит экспонирование активного участка между первым и вторым доменами рецептора. Однако метод кристаллографии не дал достоверной информации о взаимодействии урокиназы с урокиназным рецептором, потому что исследованная законсервированная структура белков не соответствует физиологическим условиям образования комплекса. Для установления изменений в структуре урокиназы при ее взаимодействии с рецептором более информативным является метод ядерного магнитного резонанса. Детальное изучение структуры ростового домена урокиназы, отвечающей за взаимодействие с урокиназным рецептором, внесет вклад в разработку результативных ингибиторов эффектов урокиназы, опосредованных ее взаимодействием с урокиназным рецептором. Известно, что суперэкспрессия урокиназы и урокиназного рецептора коррелирует с плохим прогнозом в ряде онкологических заболеваний . Именно поэтому создание ингибиторов, блокирующих взаимодействие урокиназы с рецептором, является важной задачей в проблеме лечения рака. Помимо этого, блокирование взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором позволит контролировать процессы ремоделирования тканей, роста сосудов, устраняя негативные эффекты урокиназы. Именно поэтому мы заинтересовались исследованием ростового домена урокиназы. Таким образом, целью нашей работы было изучение структуры ростового домена урокиназы и ее измененш при взаимодействии с урокиназным рецептором. Синтезировать в ii i, очистить и охарактеризовать рекомбинантные формы урокиназы человека. Сравнить полученные формы с урокиназой, экспрессированной в эукариотических клетках, по способности к связыванию с урокиназным рецептором. Изучить пространственную структуру ростового домена урокиназы. Получить стабильный препарат аминоконцевого фрагмента с изотопным замещением и С, и комплекса аминоконцевого фрагмента с урокиназным рецептором, стабильный и растворимый в высоких концентрациях в растворе с минимальным содержанием солей. Методом ЯМР изучить изменения в структуре ростового домена аминоконцевого фрагмента урокиназы при взаимодействии с урокиназным рецептором. Активатор нлазминогена урокиназного типа УК урокиназа является внеклеточной протеазой, принадлежащей к семейству сериновых протеаз2. Урокиназа с высокой специфичностью расщепляет ллазминоген, переводя его тем самым в плазмин. В организме человека урокиназа секретируется различными типами клеток моноцитамимакрофагами 9, опухолевыми клетками 6, фибробластами , гладкомышечными клетками и эндотелиальными клетками 5. Структура урокиназы . Урокиназа секретируется в виде гликозилированного малоактивного одноцепочечного белка оцУК, состоящего из 1 аминокислотных остатков. В1 ее структуре выделяют три домена ростовой домен, гомологичный по структуре эпидермальному фактору роста РД 1, а. КД 1, а. КГТ 28,. ПД Рис. Исторически РДКДКЛ принято называть аминоконцевым фрагментом АКФ. Рис. I изгиб , тип 1 изгиб , тип II . Один двухнитевой 3 и I. , V, Тгр, и сгруппированы на одной стороне Еще один ключевой контакт находится между i и . Р , ,. Чмо v. V. Г и ,зво . . I . . У V . Рисунок 1. Структура урокиназы. Урокиназа представлена в виде последовательности и. Красным обозначены НАэр5Бе а. Это взаимодействие с способствует закреплению ориентации Сконца, района двойного изгиба по отношению к большему Отличительным структурным элементом в ростовом домене является Ппетля, состоящая из семи остатков, соединяющая две нити большего В этой петле боковые цепи , и I обращены внутрь и сгруппированы к центру петли, а боковые цепи , Туг, и 2 наружу.