Митохондриальные белки-разобщители и действие супероксид-радикала на митохондрии почек и печени крыс

• Автор: Кашапова, Ирина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Митохондрии и их функции в клетке

1.2. Активные формы кислорода, их генерация и биологическое

действие

1.3. Кальций и образование АФК в митохондриях

1.4. Влияние АФК на активность ряда ферментов ЦТК и ЭТЦ

1.4.1. Аконитатгидратаза

1.4.2. Сукцинатдегидроге 1аза

1.5. Механизмы защиты клетки от повреждающего действия АФК

1.6. Разобщающее действие жирных кислот
1.7. Белки внутренней мембраны митохондрий, опосредующие разобщающее действие жирных кислот
1.7.1. АЭРАТРантипортер как разобщающий белок
1.7.2. Разобщающие белки семейства ИСР
1.7.2.1. Термогенин бурого жира млекопитающих
1.7.2.2. Тканевые гомологи иСР
Возможная физиологическая роль СР2 и иСРЗ
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 .Объекты и методы исследования
2.1.1. Объекты исследования
2.1.2. Использованные в работе реактивы
2.1.3. Выделение митохондрий из почек и печени крыс
2.1.4. Определение концентрации белка по методу Лоури 2.1.5 Полярографический метод определения поглощения
кислорода суспензией митохондрий с помощью электрода Кларка
2.1.6. Определение трансмембраниого потенциала на внутренней мембране митохондрий методом синтетических проникающих ионов с помощью тетрафенилфосфониевого электрода
2.1.7. Получение митохондриально обогащенной фракции из клубней картофеля, проростков кукурузы, печени и почек крысы и очищенного ферментативного препарата СДГ из проростков кукурузы, клубней картофеля и печени крыс
2.1.8. Спектрофотометрическос определение активности СДГ
2.1.9. Определение гомогенности фермента методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле
2.1 Исследование эффекта АФК на акони газу митохондрий печени и почек крыс
2.1 Выделение ДНК из печени крыс методом депротеинизации щелочным фенолом
2.1 Выделение РНК из печени и почек крыс
2.1 Подбор праймеров для обратной транскрипции и анализа
2.1 Реакция обратной транскрипции
2.1 в реальном времени
2.1 Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ
2.1 Статистическая обработка данных
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.2.1. Действие супероксидрадикала на параметры дыхания митохондрий почек и печени крыс и ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов и карбоксиатрактилата
2.2.2. Действие супероксидрадикала на величину мембранного потенциала митохондрий почек и печени крыс и действие пуриновых нуклеотидов и карбоксиатрактилата
2.2.3. Влияние пероксида водорода на активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях и ее очищенные препараты
2.2.4. Действие пероксида водорода и супероксидрадикала
на активность аконитазы в митохондриях печени и почек крыс
2.2.5. Дифференциальная активность генов, кодирующих иСР2, АЕРАТРантипортер и цитохромоксидазу в ткани печени и
почек крыс
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получить электрофоретически гомогенный препарат сукцинатдегидрогепазы из различных источников и оценить возможность ее ингибирования активными формами кислорода. Сравнить уровень экспрессии мРНК для 2 в почках и печени, как в абсолютных значениях, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков антипортсра и цитохромо кс и дазы. Научная новизна. Впервые показавю, что в присутствии системы генерации супероксидрадикала ксантина и ксаптиноксидазы действительно наблюдается разобщение дыхания, оцениваемое по увеличению начальной скорости дыхания, при одновременном небольшом подавлении максимальной скорости дыхания, а также падение мембранного потенциала внутренней митохондриальной мембраны. Установлено, что указанные изменения носят одинаковый качественный и количественный характер, как в митохондриях почек, так и в митохондриях печени крыс. Для оценки активации 2 использовали ингибирующее действие пуриновых нуклеотидов на разобщающие белки. Чтобы дифференцировать вклад в разобщение 2 и , был использован высокоспецифичный ингибитор . Снижение максимальной скорости дыхания препаратов митохондрий печени и почек указывает на повреждение супероксидрадикалом дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий. Нами показано, что, в условиях использования в качестве субстрата дыхания янтарной кислоты. СДГ. Данные о дифференциальной активности генов, кодирующих 2, X и цитохромоксидазу СОХ, указывают на более низкую экспрессию мРНК для 2 в почках по сравнению с печенью, как в абсолютном значении, так и относительно мРНК основных конститутивных для митохондрий белков и СОХ. Изучение ингибирующего действия пероксида водорода и супероксидрадикала на активность аконитазы АН не выявило преимущественной устойчивости митохондрий почек по сравнению с митохондриями печени, которое могло бы быть обусловлено присутствием в митохондриях почек 2. Полученные результаты позволяют предположить, что активирующее действие супероксидрадикала на зависит от физиологических условий, в которых находится ткань, и требует дополнительных изысканий. Разобщение, наблюдаемое под действием супероксидрадикала в митохондриях почек крысы, может быть интерпретировано без привлечения модели М. Бранда, базирующейся на усилении под действием супероксидрадикала протонофорной активности 2. Практическая значимость работы. Научнопрактическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации с нашей стороны существующих представлений о функциях тканеспецифических изоформ и осознании необходимости дальнейшего их исследования. Древнее происхождение и широкое распространение в клетках растений и животных говорит об их, безусловно, большом функциональном значении для эукариотических организмов. Соответственно раскрытие этих функций и использование полученных знаний на практике чрезвычайно полезно для терапии и диагностики многих заболеваний, разработки лекарственных препаратов, ветеринарии и сельского хозяйства. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биологопочвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по Биохимии, в спецкурсе Метаболизм органических кислот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 9й и й Международной школеконференции молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, , , межрегиональных конференциях, посвящнных памяти Земляиухина Организация и регуляция физиологобиохимических процессов Воронеж. Международной научной конференции Современные проблемы адаптации и биоразнообразия Махачкала, . Публикации. Основные результаты представленной работы изложены в публикациях 2 статьях в рецензируемых научных изданиях, 6 статьях в сборниках научных работ, 2 тезисах докладов научных конференций. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 8 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 6 источников. Иллюстрационный материал включает рисунок и 4 таблицы.