Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов

• Автор: Ситкин, Борис Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 143 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Распространенность бактериолитических ферментов в природе.

ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий субстрата

бактериолитических ферментов.

2.1. Клеточная стенка грамположительных бактерий.

2.2. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий.

2.3. Строение пептидогликана бактерий

ГЛАВА 3. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов

ГЛАВА 4. Бактериолитичсские ферменты бактерий

4.1. Внеклеточные бактериолитические ферменты

4.2. Автолитические ферменты бактерий
4.2.1. Физиологическая роль ферментов.
4.2.2. Спектр и субклеточная локализация автолититических ферментов бактерий
4.2.3. Свойства автолитических ферментов
4.2.4. Регуляция и контроль активности автолитических ферментов
4.3. Взаимосвязь биосинтеза внутриклеточных и внеклеточных
бактериолитических ферментов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Материалы и методы
5.1. Материалы.
5.2. Микроорганизмы и условия их культивирования.
5.3. Субклеточное фракционирование.
5.4. Солюбилизация автолитических ферментов из фракции
клеточных стенок и мембран
5.5. Определение ферментативных активностей клеточных фракций.
5.5.1. Определение глюкозо6фосфатдегидрогеназной активности
5.5.2. Определение лактагдегидрогеназной активности.
5.5.3. Определение активности циклической фосфодиэстеразы.
5.5.4. Определение автолитической активности
5.6. Турбидиметрический метод определения автолитической активности
ферментных препаратов
5.7. Определение белка
5.8. Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеточных фракций . X 1 и X
5.8.1. Электрофоретический анализ в анодной системе.
5.8.2. Электрофоретический анализ в катодной системе
5.9. Выделение пептидогликана бактерии . X
5 Определение состава пептидогликана . X
5 Определение конфигурации диаминопимелиновой кислоты
в пептидогликане . X 1.
5 Элюция автолитических ферментов из ПААГ.
5 Определение субстратной специфичности автолитических ферментов
. Обнаружение ферментов с глюкозаминидазной активностью
. Обнаружение ферментов с мурамидазной активностью.
. Обнаружение ферментов с амидазной и эндопептидазной активностями
5 Осаждение белков цитозоля сульфатом аммония.
5 Ионообменная хроматография элюата из ПААГ на сефадексе С.
5 Определение молекулярной массы цитозольной эндопептидазы А7.
. Гельфильтрация
. Электрофорез в присутствии .
5 Характеристика ферментных препаратов, содержащих эндопептидазы
Л, i и МацетилмурамоилЬаланин амидазу Аб.
. Определение оптимального значения для действия автолитических ферментов
. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия автолитических ферментов.
. Определение влияния температуры на активность автолитических ферментов
. Определение термостабильности ферментных препаратов
ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение.
6.1. Химическая структура пептидогликана . X 1.
6.2. Автолитические ферменты активного штамма . X 1,
не сскретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты.
6.3. Субстратная специфичность автолитических ферментов по отношению
к пептидогликану бактерии . X
6.4. Определение свойств наиболее активных автолитических ферментов цитозоля . X 1.
6.4.1. Оптимум действия эндопептидазы и Мацстилмурамоил1аланин амидазы Аб.
6.4.2. Зависимость активности эндопснтидазы и Мацстилмурамоил1у атанин амидазы Аб от ионной силы раствора
6.4.3. Оптимум температуры реакции эндопептидазы .
и КацетилмурамоилЬаланин амидазы Аб
6.4.4. Термостабилыюсть эндопептидазы А5 и
Мацетилмурамоил1уаланин амидазы Аб.
6.5. Автолитические ферменты активного штамма ЬуБоЬасег Бр. ХЬ1, секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты
6.6. Сравнение субстратной специфичности автолитического фермента А
и внеклеточного фермента Л
6.7. Автолитические ферменты малоактивного штамма
уБоЬааег Бр. ХЬ 2.
6.8. Выделение, очистка и свойства цитозольной эндопептидазы А
6.9. Заключение
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Получен очищенный препарат цитозольной эндопептидазы, выявленной только в клетках ЬуяоЬасег яр. ХЬ 1, секретирующих внеклеточные бактериолитические ферменты. Показано, что этот фермент имеет ряд свойств, аналогичных свойствам внеклеточной эндопептидазы Ль Это и тот факт, что цитозольная эндонептидаза отсутствует в клетках ЬухоЬааег яр. ХЬ 2, утративших способность секретировать внеклеточную эндопептидазу Ль позволило предположить, что цитозольная эндопептидаза может являться предшественником внеклеточной эндопептидазы. Научнопрактическое значение. Полученные в работе новые данные расширяют наше представление о механизме функционирования внутриклеточных и внеклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Настоящая работа по своему характеру относиться к разряду фундаментальных исследований. Однако, полученные результаты имеют также и практическое значение, так как они могут быть использованы для оптимизации условий секреции внеклеточных бактериолитических ферментов ЬуьоЪааег яр. ХЬ 1, выяснения перспективности обогащения автолитическими ферментами медицинского препарата лизоамидаза, и как следствие улучшение его качества и бактериолитических свойств. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Распространенность баюгсриолитических ферментов в природе. Бактериолитическими ферментами принято называть ферменты, способные разрушать клеточные стенки бактерий и, тем самым, вызывать лизис бактериальной клетки. Еще в начале XX века ученые обратили внимание на способность выделений и экстрактов тканей животных лизировать суспензии некоторых грамположительных бактерий. Так, в г русский ученый Н. Лященко впервые описал бактсриолитические свойства белка куриного яйца и предположил, что это может быть связано с присутствием в нем специфического энзима Егоров, . Спустя лет английский микробиолог А. Флеминг открыл и выделил из некоторых биологических жидкостей и тканей человека лизоцим бактериолитичсский фермент, разрушающий клеточные стенки бактерий i, С тех пор и до настоящего времени ведется интенсивная работа по изучению бактериолитических ферментов. Сейчас известно, что способность продуцировать и использовать бактсриолитические ферменты является одной из общих черт всех живых организмов, от вирусов до человека , . I . Головина, Головина и др. Звягинцева, Бухарин, Усвяцов, Кузнецов и др. Vi . Кулаев и др. Захарова, Павлова, , , , , , Степная и др. Наиболее распространенными и изученными бактериолитическими ферментами растительного, грибного и животного происхождения являются лизоцимы. Они были обнаружены в молоке, слизи, моче и тканях животных, а также в некоторых тканях растений и грибов , . I . Кроме лизоцимов, в сыворотках человека и некоторых млекопитающих также были обнаружены бактсриолитические Гацетилмурамоилаланин амидазы Vi . Принято считать, что бактериолитические ферменты растений, животных и других высших организмов являются частью их иммунной системы и выполняют защитные функции I . Vi . Самый широкий спектр бактериолитических ферментов обнаружен у бактерий. Бактериолитические ферменты бактерий по функции и локализации принято разделять на две группы. Первую группу составляют внутриклеточные автолитические ферменты, выявленные у всех изученных бактерий. Они играют ключевую роль в росте и делении бактериальной клетки и поэтому являются для них жизненно необходимыми . К этой группе также относятся литические ферменты бактериальных спор, которые активируются в период их прорастания , , i . Вторая группа это внеклеточные бактериолитические ферменты. Способность секретировать внеклеточные бактериолитические ферменты широко распространена как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. У грамотрицательных бактерий наибольшее количество активных культур встречается среди представителей рода , а у грамположительных i, , и ii Звягинцева, , , i . Внеклеточные бактериолитические ферменты бактерий, с одной стороны выполняют защитные функции, а с другой являются факторами агрессии и участвуют в завоевании бактериейпродуцентом области обитания и в снабжении се пищей i, , Кулаев и др. Степная и др.