Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике

• Автор: Мамукова, Юлия Иосифовна
• Шифр специальности: 03.00.04, 14.00.29
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 80 с. : ил.

Оглавление Стр.

Введение

1 .Обзор литературы

1.1 Значение определения витамина В, фолиевой кислоты,

гомоцистсина и трансферринового рецептора

1.2 Характеристика современных методов анализа, используемых для

определения витамина В, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора

Собственные результаты

2. Материалы и методы

2.1 Получение конъюгатов ВБСА и фолБСА

2.2 Получение конъюгатов НсуПАК и НсуБСА

2.3 Получение антисывороток
2.4 Проведение иммуноферментного анализа
3. Результаты исследований
3.1 Разработка иммуноферментного метода определения вшгамина В,
фолатов и гомоцистеина.
3.2 Приготовление растворов калибраторов
3.3 Оптимизация иммуноферментного анализа витамина В
3.4 Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного
анализа для определения фолиевой кислоты
3.5 Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения витамина В и фолатов
3.6 Разработка метода определения гомоцистеина
3.7 Разработка метода определения трансферринового рецептора
3.8 Клиническое использование разработанных тестов
3.8.1 Определение витамина В и фолиевой кислоты при ряде гематологических заболеваний
3.8.2 Определение гомоцистеина при гематологических и мнкрореологических заболеваниях
3.8.3 Определение трансферринового рецептора при гематологических нарушениях
Заключение
Выводы
Список литературы


Этот процесс осуществляется путем связывания трансферрина плазмы, насыщенного железом, странсферриновым рецептором с последующей интернализацией образовавшегося комплекса в эндоплазматическую везикулу путем эндоцитоза, где железо освобождается из комплекса с белком при уменьшении . ТфР освобождается из ретнкулоцитов во время их созревания до эритроцитов. Уровень растворимого трансферринового рецептора, присутствующего в плазме, позволяет судить о состоянии гемопоэза, поскольку при недостатке в клетке свободного железа происходит увеличение синтеза ТфР, а следовательно, и увеличение поступления железа в клетку. При избытке железа в клетке синтез рецептора прекращается. Эритроидные клетки содержат основную массу трансферринового рецептора в организме. В норме плазма содержит небольшое количество ТфР 1,5 2,5 мкгмл. Концентрация ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецегттора на незрелых эритроидных клетках. В связи с этим при истинных ЖДА уровень растворимого трансферринового рецептора резко повышен в отличие от анемии воспалений и хронических заболеваний. Поэтому определение уровня трансферринового рецептора включают в методы дифференциальной диагностики этих анемий. Поскольку все указанные соединения находятся в сыворотке крови в крайне незначительных количествах, определение их возможно лишь современными высокочувствительными методами анализа, такими как радио, флюро или ферментоиммунными. В настоящее время отечественных наборов для определения витамина В, фолатов, гомоцистеина и ТфР нет, а выпускаемые за рубежом дороги и их применение возможно только при наличии специального оборудования автоматизированных закрытых систем. В связи с этим целью нашей работы является разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора. Получить конъюгаты витамина В с бычьим сывороточным альбумином БСА, фолатов с БСА, аденозил гомоцистеина с БСА с полиакриловой кислотой ПАК, необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов. Оптимизировать параметры проведения иммуноферментной реакции для количественного определения В, фолатов, гомоцистеина Нсу. Провести эксперименты по получению реагентов для иммуноферментного анализа ТфР очищенного препарата ТфР и кроличьих антисывороток к ТфР и разработать методику количественного определения ТфР методом твердофазного ИФА. Оцсшгть клиническую информативность разработанных методов количественного определения витамина В, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора. Разработан оригинальный подход для получения антисыворотки против гомоцистеина на основании использования конъюгата БаденозилЬгомоцистеина с полимером полиакриловой кислотой, обеспечивший получение антнсывороток с высоким уровнем специфических антител и высокой константой аффинности, необходимых для целей ИФА. Разработаны иммуноферментиые количественные методы анализа витамина В, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансфсрринового рецептора. Показана высокая информационная значимость комплексного определения витамина В, фолиевой кислоты и трансфсрринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий. Показана целесообразность контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов и микроциркуляторными нарушениями для выбора оптимальной тактики лечения. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения витамина В, фолатов, гомоцистеина и трансферрннового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа. Разработаны и утверждены Ученым Советом Гематологического научного цегтра РАМН методические рекомендации Иммуноферментный метод определения витамина В и фолиевой кислоты протокол 4 от мая г. С г. ГНЦ РАМН. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развгтия тромбозов. Материалы, вложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН Москва, . Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии ГНЦ РАМН Москва, 1 июля .