Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами

• Автор: Шкроб, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Используемые сокращения

I.Введени е

II.Обзор литературы

II. 1 подобные белки

II.I.I Зеленый флуоресцентный белок медузы vii .

II. 1.2 подобные белки коралловых полипов . IО

Структура подобных белков

Структура хромофора

Влияние конформации хромофора на флуоресцентные свойства.

Функции подобных белков иебиолюминесцентных кораллов.

Распространение подобных белков
Эволюция семейства 2
Структурные особенности подобных хромобелков.
II. 1.3 Методы использования подобных хромобелков
Фотоактквирусмые хромобелки
Хромобелки как акцепторы для резонансного переноса энергии.
Использование мутантных вариантов хромобелков в двухцветовой флуоресцентной кросскорреляционной спектроскопии.
Использование хромобелков для создания псевдомономерных меток.
Флуоресцентные белки с эмиссией в дальнекрасной области спектра.
II.2 Фотосеисибилизаторы и их использование.
Флуоресцентные белки в качестве генетическикодируемых
фотосенсибилизаторов.
Фотодинамическая терапия ФДТ.
III. Экспериментальная часть.
IV. Результаты и обсуждение
Создание флуоресцентного белка с эмиссией и дальнекрасной области спектра на основе хромобелка из ii i
Получение фототоксичного белка на основе хромобелка медузы.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Одним из способов реализовать этот подход является методика светозависимой инактивации целевых молекул посредством соединения, способствующего образованию активных форм кислорода при облучении, фотосенсибилнзатора I i i iivi. Фотосенспбилизаторы находят применение не только области научных исследований, но и в прикладной медицине. СРРподобные хромобелки представляют собой особый научный интерес и с теоретической, и с прикладной точки зрения. Ученым еще предстоит выяснить природную функцию хромобелков и их филогенетическое разнообразие. В работе дан обзор современных представлений об этой группе ОРРподобных белков и их практических приложений и продемонстрирована возможность использования хромобелков как основы для получения белков с новыми свойствами флуоресцентных белков с эмиссией в дапьискрасной области спектра и фототоксичных белков. II. II. В г. Л vii был обнаружен зеленый флуоресцентный белок i. . Спустя тридцать лет был клонирован кодирующий его ген . Оказалось, что этот ген может быть успешно экспрессирован практически в любом организме с образованием флуоресцентного белка , благодаря уникальной способности формировать хромофорную группу самостоятельно, без участия какихлибо внешних ферментов и кофакторов, за исключением молекулярного кислорода . Это дат возможность использовать для визуализации разнообразных процессов, проходящих в живых клетках. Широкие перспективы использования в качестве генетическикодируемой флуоресцентной метки дали импульс исследованию структуры, биохимических и биофизических свойств этого белка. Методами направленного мутагенеза и мутагенеза со случайными заменами на основе были получены различные спектральные варианты, пик эмиссии флуоресценции которых приходился на синюю, голубую или желтозеленую области видимого спектра , . В г. были найдены в представителях коралловых полипов класса . Были клонированы кДНК сразу нескольких белков, в том числе неизвестные ранее природные желтые и красные флуоресцентные белки . Также в коралловых полипах , и, позднее, в гидроидных медузах , 1 была обнаружена особая группа гомологов нефлуоресцентные хромобелки. Зеленые флуоресцентные белки были также найдены в некоторых видах рачков тип Членистоногие , а в г. Хордовые ланцетниках . . II. был открыт в г. vii. Рис. В центре молекулами экворина. , что приводит к сдвигу эмиссии в зеленую область спектра. Была определена молекулярная масса кДа измерены спектры возбуждения и эмиссии белок имеет два пика возбуждения 5 и 5 нм и пик эмиссии при 8 нм определен квантовый выход флуоресценции , который составляет 0. В г. . рис. Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что полипегггидная цепь уложена в образованный аитипараллельными , а длина А. В центре Защищенный белковой глобулой хромофор полностью изолирован от растворителя и контактирует только с теми аминокислотами, боковые цепи которых погружены внутрь Главной особенностью , позволяющей использовать его в гетерологичных системах экспрессии, является способность формировать хромофор внутри белковой глобулы без привлечения внешних органических кофакторов. Хромофор образуется путем циклизации белкового остова во фрагменте Гуг с образованием имидазолин5она и последующей дегидратации метиленового мостика боковой цепи остатка Тугбб. В результате образуется структура с системой сопряженных двойных связей, способная поглощать и испускать свет в видимой области спектра рис. Наличие двух пиков в спектре возбуждения объясняется тем, что хромофор может существовать в двух формах ионизованной и нейтральной 7. Помимо аминокислот, непосредственно входящих в состав хромофора, известны еще две крайне консервативные среди флуоресцентных белков позиции это и 2. Повидимому, эти остатки необходимы для образования хромофора , . СО1. Рис. Схема образования хромофора .