Получение рекомбинантных белков OprL и OprI наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммунобиологических свойств

• Автор: Гатыпова, Екатерина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синсгнойная инфекция

1.2. Поверхностные антигены синегнойной палочки

1.3. Перспективы создания генноинженерных вакцин против

. i на основе белков наружной мембраны.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.1.1. Использованные штаммы

2.1.2. Исследуемые белки и сыворотки
2.1.3. Экспериментальные животные.
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование штаммов . i
2.2.2. Выделение геномной ДНК из . i
2.2.3. ПЦР
2.2.4. Рестрикция ДНК и выделение ДНК из агарозного геля
2.2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.
2.2.6. Лигирование
2.2.7. Приготовление компетентных клеток
2.2.8. Трансформация компетентных клеток
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК.
2.2 Определение нуклеотидных последовательностей ДНК.
2.2 Экспрессия генов рекомбинантных белков.
2.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле ПААГ по
2.2 Хроматографическая очистка рекомбинантных белков
2.2 Иммуноблоттинг
2.2 Приготовление лизата .i.
2.2 Иммуноферментный анализ ИФА.
2.2 Приготовление препаратов для иммунизации
2.2 Заражение животных культурой . i
2.2 Получение иммунных сывороток
2.2 Изучение антибактериальных свойств иммунных сывороток
2.2 Статистические методы.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЖОВ и Орг НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ . I.
3.1. Клонирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки и .
3.2. Синтез, очистка и оценка специфичности рекомбинантных белков и .
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТТЫХ БЕЛКОВ и
4.1. Изучение имуногенных свойств рекомбинантных белков и в сравнении с
4.2. Изучение протективиых свойств рекомбинантного белка в сравнении с белком на экспериментальной модели синегнойной инфекции
4.3. Изучение антибактериальных свойств мышиных сывороток к рекомбинантным белкам и
ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОЛИЧЬИХ СЫВОРОТОК К РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКАМ , и
5.1. Получение кроличьих сывороток к рекомбинантным белкам , и
5.2. Изучение антибактериальных свойств и оценка специфичности иммунных кроличьих сывороток.
5.3. Исследование превентивных свойств иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантным белкам и
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Особый интерес по данным литературы представляет пориновый белок с молекулярной массой около кДа, присутствие которого выявлено в клеточной стенке у представителей Р. Большинство возбудителей, относящихся к группе условнопатогенных, и в том числе синегнойная палочка, серологически неоднородны. Это обстоятельство на протяжении многих лет является главным препятствием для создания эффективных вакцин. Липопротсины также являются важной составной частью наружной мембраны грамотрицательных бактерий, обеспечивая целостность клетки. У синегнойной палочки выявлено два основных липопротеина, обладающие иммуногенными свойствами белки наружной мембраны и I и I, имеющие молекулярную массу около и кДа, соответственно . В настоящее время накоплен опыт использования мембранных белков в качестве вакцинных препаратов. На их основе в НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова разработана субъедииичная псевдомонасвакцина, обладающая протективными свойствами . Основу данной вакцины, полученной классическими методами, составляли мембранные белки . Позднее в Корее на ожоговых больных успешно испытана вакцина, полученная из очищенных белков наружной мембраны . Поскольку белки наружной мембраны в бактериальной клетке содержатся в незначительном количестве, получение вакцин на их основе традиционными биотехнологическими приемами дорогостоящий и трудоемкий процесс. В настоящее время активно ведутся работы по созданию препаратов нового поколения с использованием генноинженерных технологий. Расшифрованный геном синегнойной палочки 1 и накопившаяся информация об иммуногенной активности определенных поверхностных белков открывают перспективу подобных исследований. К настоящему моменту получены данные об успешном использовании препаратов, созданных на основе рекомбинантных белков, включающих аминокислотные последовательности белков и I. Так, в Германии проведены клинические исследования на ожоговых больных рекомбинантного белка, включающего Сконцевой фрагмент 02 аминокислотные остатки и I аминокислотные остатки. Е. i, которые несли плазмидную конструкцию со встроенным рекомбинантным геном с регуляторными участками для его экспрессии . Выявлена безопасность и отсутствие реактогенности полученного препарата при испытании на добровольцах 9. Па основе генов оргЕ и ведутся разработки ДНКвакцин на базе плазмидных векторов 1 и с использованием аденовирусов 4. В НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН клонирован в Е. . Доказана высокая специфичность синтезируемого продукта, а также возможность его получения в очищенном виде с помощью ионноафинной хроматографии на iагарозе. Отработан метод детекции специфических антител, образующихся в организме иммунизированных животных. При исследовании полученного рекомбинантного белка и иммунных кроличьих сывороток к нему выявлено, что они способны защищать мышей от экспериментальной синегнойной инфекции 9. Однако, учитывая наличие ряда мембранных белков у . и , а также возможности генноинженерных методов для получения последних в количествах, достаточных для биологического тестирования, представляется актуальным исследование их роли в формировании специфической защиты от синегнойной инфекции. Цель работы получение рекомбинантных белков наружной мембраны и . Сконструировать бактериальные Е. и . Получить очищенные рекомбинантные белки и . Провести сравнительное изучение иммуногенных свойств полученных белковых препаратов и поринового рекомбинантного белка на экспериментальных животных. Получить иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам , и . С использованием генноинженерных технологий сконструированы бактериальные Е. и I наружной мембраны . Получены очищенные рекомбинантные белки и . Рекомбинантный белок обладал прогективными свойствами, сопоставимыми со свойствами поринового белка . Выявлены превентивные свойства иммунных кроличьих сывороток к рекомбинантному белку .